Появление в канадской провинции Альберта карбапенемазо-продуцирующих грамотрицательных бактерий, связанное с зарубежными поездками: первые 3 года наблюдений

25.08.2014

Gisele Peirano,^a,b Jasmine Ahmed-Bentley,^6,f Jeff Fuller,^6,9 Joseph E. Rubin,^a,b,d Johann D. D. Pitout^a,c

Микробиологический отдел Лабораторной службы Калгари³и отдел патологической и лабораторной медицины^b и микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней⁰Университета Калгари (Калгари, Альберта, Канада); Отдел ветеринарной микробиологии Университета Саскачевана (Саскатун, Канада)^d; Отдел лабораторной медицины и патологии Университета Альберта (Эдмонтон, Альберта, Канада)^e; компания DynaLIFE_DX(Эдмонтон, Альберта, Канада)^f; Государственная медицинская лаборатория (Эдмонтон, Альберта, Канада)^g

В этой статье мы приводим описание характерных особенностей зарегистрированных в провинции Альберта (Канада) в 2010-2013 гг. случаев инфекции или колонизации каррбапенемазо-продуцирующих грамотрицательных бактерий у лиц, заражение которых было связано с предшествовавшими поездками за пределы Канады. Культуры бактерий с повышенной чувствительностью к антибиотикам, выявленной методом серийных разведений в бульоне, тестировали в ПЦР и типировали посредством секвенирования и мультилокусного секвенирования. Изучали возможность совместно культивируемых в жидкой среде бактерий обмениваться плазмидами антибиотикорезистентности, характеристики которых в последующем определяли. Все пациенты (n= 12), обследованные в ходе проведения данной работы, в период пребывания за рубежом имели контакты с медицинскими лечебными учреждениями. У большинства из них были инфекции мочевыводящих путей (ИМП), что послужило основанием для их госпитализации в течение нескольких недель после возвращения в провинцию Альберта. В одном случае произошла вторичная передача инфекции, что стало причиной смерти другого пациенту. Выделили 17 культур карбапенемазо-продуцирующих бактерий: Escherichia coli (секвенс типы 101 [ST101], ST365, ST405 и ST410) с NDM-1, Klebsiella pneumoniae (ST15, ST16, ST147, ST258, ST340, ST512 и ST972) с NDM-1, OXA-181, KPC-2 и KPC-3, Acinetobacter baumanniiс OXA-23, Providencia rettgeriс NDM-1, Enterobacter cloacaeс KPC-2 и Citrobacter freundiiс NDM-1. Наличие гена bla_NDM_-1ассоциировалось с обнаружением у бактерий плазмид, имеющих узкий (IncF) и широкий (IncA/Cи IncL/M) круги хозяев, а также несущих дополнительные факторы. Полученные нами результатыпоказали, что продуцирующие NDM штаммы K. pneumoniae относятся к разным секвенс-типам, имеющим неодинаковый набор опасных плазмид, регулярно попадающих в провинцию Альберта из Индии. Клинические микробиологические лаборатории должны уделять особое внимание обнаружению бактерий с карбапенемазами.

Грамотрицательные бактерии, особенно Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, являются одними из наиболее важных возбудителей тяжелых госпитальных и внебольничных бактериальных инфекций человека. Возрастает значение проблемы резистентности этих агентов к антимикробным препаратам (1). Особую озабоченность вызывает развитие резистентности микроорганизмов к карбапенемазам, поскольку только с помощью этих антибиотиков можно эффективно лечить инфекционные заболевания, вызванные мультирезистентными грамотрицательными бактериями (2). В этой связи крайне важно выявлять штаммы бактерий, образующие карбапенемазы - ферменты, ответственные за резистентность к карбапенемам. Эти ферменты относят к 3 классам бета-лактамаз: A (KPC), B (металло-бета-лактамазы, в т.ч. VIM, IPM и NDM) и D (оксациллиназы, например, OXA) (3).

NDM впервые описали у штамма K. pneumoniae, выделенного в Швеции у пациента, ранее проходившего лечение в одной из клиник Нью-Дели (Индия) (4). В последующем бактерии с NDM-1 обнаружили более, чем в 40 странах всех континентов, за исключением Антарктики, и эти микроорганизмы стали считать эндемичными для Индийского субконтинента (5). NDM-1 наиболее часто встречается у E. coli и K. pneumonia, но этот фермент способны образовывать и другие представители семейства Enterobacteriaceae, а также Acinetobacterspp., Pseudomonas spp. и Vibrio cholerae (6, 7).

О KPC впервые сообщили в конце 1990-х гг., когда один из ферментов этой группы обнаружили у штамма K. pneumonia, который выделили в Северной Каролине. В настоящее время описано свыше 10 различных вариантов КРС (8). Бета-лактамазы KPC (особенно KPC-2 и 3) обнаружили у разных видов энтеробактерий, особенно Klebsiella spp. и E. coli (9). Сообщалось о ряде госпитальных вспышек, вызванных продуцентами КРС, в США, странах Европы, Южной Америки, Азии и Ближнего Востока (8, 10, 11). Продуцирующие KPC бактерии считают эндемичными для ряда регионов мира, включая северо-восточные регионы США, Пуэрто-Рико, Колумбию, Грецию, Израиль и Китай, а также важной причиной госпитальных инфекций в некоторых районах других стран (11).

В мае 2013 г. Служба здравоохранения провинции Альберта (Канада) выпустила рекомендации по контролю инфекций, вызываемых продуцирующими карбапенемазы грамотрицательными бактериями (12). Непосредственным поводом для создания данного документа стала вспышка инфекции, зарегистрированная в провинции Альберта в апреле 2012 г. Служба здравоохранения Альберты обязала провинциальные органы здравоохранения сообщать о пациентах, у которых выявлена колонизация такими бактериями, и направлять их культуры в местный центр контроля антибиотикорезистентности для дополнительного изучения и подтверждения наличия у них специфических механизмов антибиотикорезистентности. Мы предприняли попытку изучить особенности инфекций, вызванных продуцентами карбапенемаз, занесенными в провинцию Альберта (Канада) из-за рубежа в течение 3-летнего периода, предшествовавшего разработке упомянутых выше рекомендаций Службы здравоохранения провинции.

(Данная работа была представлена на 53-й междисциплинарной конференции по химиотерапии антимикробными препаратами, проходившей в Денвере (Колорадо, США) 10-13 сентября 2013 г. [13].)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Провинция Альберта (Канада). Провинция Альберта расположена на западе Канады. Она занимает четвертое место среди остальных провинций страны по численности населения, которое превышает 3,7 млн. человек. Для нее характерно этническое разнообразие, на долю выходцев из Китая и Восточно-Индийского региона приходится около 7% населения, а численность коренных жителей провинции составляет приблизительно 3%. Также, как и в других частях Канады, большая часть жителей провинции приехала из Англии, Шотландии, Ирландии и Уэлса, очень многие из них раньше жили в других странах Европы, в первую очередь в Германии, Франции, Украине и Скандинавии. Провинция Альберта занимает второе место в Западной Канаде (после провинции Манитоба) по численности (2%) франкоязычных жителей.

Служба здравоохранения провинции Альберта отвечает за контроль и обеспечение здоровья взрослых и детей, проживающих на данной территории. Она создана таким образом, чтобыподразделения экстренной медицинской помощи функционировали независимо от небольших госпиталей и социальных служб, последние из которых организованы по территориальному принципу в 5 зонах (Северной, Южной, Эдмонте и Центральном Калгари). В Центральном Калгари находится 5 основных подразделений экстренной медицинской помощи, в т.ч.Медицинский центр в Футхилле, Центр Петера Лоугхидаe, Главный госпиталь Роккивью, Южный Университетский госпиталь иДетский госпитальАльберты. В городских частях зоны Эдмонтон находится 8 таких госпиталей, в т.ч. Госпиталь Университета Альберты (Эдмонтон), Госпиталь короля Александра (Эдмонтон), Госпиталь Сестер милосердия (Эдмонтон), Госпиталь общины Мизерекордия (Эдмонтон), Госпиталь общины Старжеон (Сант-Альберт), Госпиталь общины Ледук (Ледук), Медицинский центр ВестВью (Стонри Плейн) и Госпиталь общины Форт Саскатчеван (Форт Саскатчеван).

Пациенты. Первый случай заноса карбапенемазо-продуцирующей бактерии из-за рубежа зарегистрировалив апреле 2010 г., когда выделили штамм E. coli с NDM-1 от пациента с пиелонефритом и простатитом, вернувшегося в Канаду после госпитализации в Индии (14). В последующий 3-летний период (до конца апреля 2013 г.) выявили еще 11 случаев инфекции или колонизации карбапенемазо-продуцирующих бактерий. Большую часть из них (n = 7) диагностировали в зоне Эдмонтон, 4– в зоне Калгари и 1 – в Южной сельскохозяйственной зоне. О некоторых из этих случаев (n = 4) уже сообщалось ранее (14-17); однако, в последующий период нами идентифицирована инфекция продуцентов карбапенемаз еще у 8 пациентов и получены дополнительные характеристики (данные о плазмидах ифакторах вирулентности) выделенных от них возбудителей, о чем не сообщалось в первой публикации.

Скрининг пациентов на наличие карбапенемазо-продуцирующих бактерий. В микробиологических лабораториях Эдмонта и Калагари проводили скрининговые посевы проб, взятых из прямой кишки, ран, стоми эндотрахеального аспирата пациентов с целью выявления среди них всех эпидемически опасных лиц, колонизированных продуцентами карбапенемаз. Проведением этих исследований и организацией мер по недопущению дальнейшего распространения опасных инфекций в каждом центре экстренной медицинской помощи руководили местные Департаменты профилактики и контроля инфекций. Скрининг объектов внешней среды и служащих медицинских учреждений не проводили.

Зонды-тампоны со взятыми для скрининговых исследований пробами доставляли в лаборатории в транспортной системе Copan M40 Transystem, содержащей полужидкую (гелевую) транспортную среду Эймса, а пробы фекалий и эндотрахеальных аспиратов – в стерильных контейнерах без транспортной среды. Для обнаружения в клиническом материале бактерий, продуцирующих карбапенемазы, пользовались протоколом Центра контроля и профилактики болезней (CDC, Атланта, США) (18).

Чувствительность к антимикробным препаратам. На анализаторе MicroScan NEGMIC определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) бактерий к следующим антимикробным препаратам: амоксициллин-клавулановой кислоте (AMC), пиперациллин-тазобактаму (TZP), цефокситину (FOX), цефтриаксону (CRO), цефтазидиму (CAZ), азтреонаму (ATM), имипинему (IPM), меропенему (MER), эртапенему (ERT), амикацину (AMK), гентамицину (GEN), тобрамицину (TOB), ципрофлоксацину (CIP), триметоприм-сульфаметоксазолу (SXT) и тигециклину (TIM). Дополнительно оценивали их чувствительность к колистину (CST) с помощью E-теста, который проводили в соответствии с инструкцией производителя. Полученные результаты в большинстве случаев интерпретировали по критериям CLSI (2012 т.) для метода серийных разведений (19). Чувствительность бактерий (например, K.pneumoniae и E. coli) к CST определяли по точкам отсечения (breakpoints), предложенным Европейским комитетом по тестированию антимикробной чувствительности (EUCAST), а для оценки чувствительности бактерий к TIM пользовались значением данного показателя, регламентированного FDA.

Выявление бета-лактамаз. Наличие карбапенемаз определяли в модифицированном тесте «клеверного листа» (19) и с помощью комбинированных (двойных) дисков Mastdiscs ID (20) (Маст Групп Лтд, Мерсисайд, Великобритания). ПЦР и секвенирование генома выделенных культур бактерий на наличие генов bla_SHV, bla_TEM, bla_CTX-M, bla_CMY, bla_KPC, bla_VIM, bla_IMP, bla_NDM, bla_OXA-48-like, bla_OXA23-like, bla_OXA24-like,bla_OXA51-likeи bla_OXA58-likeосуществляли в термоциклере GeneAmp 9700 ThermoCycler instrument (Applied Biosystems, Норуолк, Коннектикут, США) – условия проведения ПЦР и праймеры описаны ранее (6, 14, 21-24). Гены ISABA125 и ble_MBLу бактерий с геном bla_NDM, выявляли в ПЦР, условия проведения которой и праймеры описаны ранее (6), в то время, как у генов bla_KPC идентифицировали разные изоформы Tn4401 (i.e., a, bиc) методом, предложенным Cuzon и коллегами (25).

Плазмидные детерминанты резистентности к хинолонам. Гены qnrA, qnrS и qnrB амплифицировали в мультиплекс-ПЦР (26). Гены AAC(6')-Ib и qepA амплифицировали в разделительной ПЦР, условия проведения которой и праймеры описаны ранее (27, 28). Вариант гена aac(6')-Ib-cr в последующем выявляли посредством обработки BstF5I.

Метилирование 16S рРНК. Гены, кодирующие 16 РНК-метилазы, амплифицировали по ранее описанной методике (29, 30).

Мультилокусное секвенс-типирование. Мультилокусное секвенс-типирование (МЛСТ) генома K. pneumoniae проводили по 7 консервативным конституционным генам (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB и tonB) по ранее описанной методике (31). МЛСТ генома E. coli осуществляли по 7 консервативным конституционным генам (adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA и recA). Детальный протокол МЛСТ, включающий описание методов определения типа аллелей и секвенс-типа (СТ),приведен в Базе данных МЛСТ Исследовательского института внешней среды (ERI) и на веб-сайте Университетского колледжа в Корке (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli). МЛСТ генома A.baumannii проводили по 7 консервативным конституционным генам (cpn60, fusA, gltA, pyrG, recA, rplB и rpoB). Детальный протокол МЛСТ, включающий описание методов определения типа аллелей и секвенс-типа (СТ), приведен в Базах данных МЛСТ Пастеровского института (http://www.pasteur.fr/recherche/ genopole/PF8/mlst/primers_Abaumannii.html).

Анализ плазмид. Размеры плазмид энтеробактерий оценивали по описанной ранее методике (32) и устанавливали их принадлежность к несовместимым группам посредством типирования репликонов в ПЦР (33, 34). Наличие систем плазмидной аддикции определяли в ПЦР по описанной ранее методике (35). Эксперименты по конъюгации плазмид проводили в питательном агаре с меропенемом (MER) (1 пкг/мл), реципиентом служил штамм E. coli J53 (азид, 100 пкг/мл).

Факторы вирулентности E. coli и K. pneumoniae.В мультиплексной ПЦР проверяли наличие у выделенных штаммов E. coli конституционного гена uidA (бета-глюкуронидазы) и генов, ассоциированных с факторами вирулентности экстраинтестинальных патогенных штаммов E. coli (ExPEC)(36): F10 papA (субъединичный вариант Pфимбрий), papACEFG (гены оперона P фимбрий), sfa/foc (фимбрии S или F1C), focG (фимбриальный адгезин F1C), iha (адгезивный сидерофор), fimH (фимбрии типа 1), tsh (термочувствительный гемагглютинин), hra (терморезистентный агглютинин), afa/dra (Dr-связывающие адгезины), hlyD (α-гемолизин), sat (секретируемый аутотранспортный токсин), pic (сериновая протеаза), vat (вакуолизирующий токсин), astA (токсин энтероаггревативного варианта E.coli), cnF1 (цитотоксический некротический фактор), iroN (сальмохелиновый рецептор [сидерофор]), fyuA (йерсиниобактиновый рецептор [сидерофор]), ireA (сидерофоровый рецептор), iutA (аэробактиновый рецептор [сидерофор]), kpsMII (капсула группы 2), K1, K2 и K5 (варианты капсулы группы 2), kpsMIII (капсула группы 3), usp(уропатоген-специфический протеин), traT (фактор, ассоциированный с резистентностью к сыворотке), ompT (протеаза Т наружной мембраны), iss (фактор, повышающий выживаемость в сыворотке), H7 fliC (вариант флагеллина) и malX (маркер острова патогенности). Выделенные штаммы E.coli относили к группе ExPEC, если у них обнаруживали более 2 из следующих генов:papAи/или papC (мажорная субъединица фимбрий P и их комплекса), sfa/focDE (фимбрииSи F1C), afa/draBC (Dr-связывающие адгезины) и kpsM II (капсула группы 2).

ТАБЛИЦА 1. Клиническая характеристика пациентов, инфицированных или колонизированных бактериями-продуцентами карбапенемаз во время зарубежных поездок

№ пациен-та	Культура (ы)	Возраст (лет)	Пол	Дата поездки за рубеж (мес/г)^&	Страна	Обращение за медицинской помощью после возвращения из поездки	Вторичное распростра-нение патогенов	Симптоматика	Источник информации
1	E. coli MH01	32	M	4/2010	Индия (госпитализация в лечебное отделение из-за диабетического криза	Да (терапевтическое отделение для лечения ИМП)	Нет	ИМП	14
2	K. pneumoniae KpCG01	52	F	2/2011	Индия (госпитализация в хирургическое отделение для проведения небольшой хирургической операции)	Нет	Нет	ИМП	16
3	K. pneumoniae NT11-19	21	M	5/2011	Индия (госпитализация в хирургическое отделение после огнестрельного ранения)	Да (хирургическое отделение для лечения флегмоны)	Нет	Флегмона (после ранения ноги)	Настоящее исследование
4	C. freundii NT11-22	87	M	6/2011	Индия (госпитализацияв медицинское отделение из-за приступа гипертонии)	Yes (терапевтическое отделение для контроля гипертонии)	Нет	Ректальная колонизация	Настоящее исследование
5	K. pneumoniae KpCG02	82	M	11/2011	Греция (госпитализация в медицинское отделение из-за непроходимости мочевыводящих путей)	Нет	Нет	ИМП	17
6	K. pneumoniae KpCG03	61	M	11/2012	Индия (госпитализация в урологическое отделение для установки мочевого катетера)	Да (урологическое отделение для лечения ИМП)	Нет	ИМП	Настоящее исследование
7	E. coli RN12-40	52	M	6/2012	Индия (госпитализация в реанимационное отделение после получения травмы и для переливания крови)	Да (хирургическое отделение для лечения травмы)	Нет	Ректальная колонизация	Настоящее исследование
8	E. coli RN12-50, K. pneumoniae RN12-59	91	F	7/2012	Индия (госпитализация в терапевтическое отделение из-за застойной сердечной недостаточности)	Да (терапевтическое отделение для лечения ИМП)	Нет	ИМП	Настоящее исследование
9	E. coli EC01, K. pneumoniae KP01, A. baumannii AB01, K. pneumoniae KP02	62	F	3/2013	Индия (госпитализация в хирургическое и реанимационное отделения из-за травмы)	Да (хирургическое отделение для лечения флегмоны)	Да	Флегмона (после ранения ноги), ректальная колонизация	(15)
10	P. rettgeri UR53778, K. pneumoniae KPY18268	83	F	3/2013	Индия (госпитализация в терапевтическое отделение по причине ИМП)	Да (терапевтическое отделение для лечения ИМП)	Нет	ИМП	Настоящее исследование
11	K. pneumoniae M2800	38	M	4/2012	Израиль (госпитализация в хирургическое отделение после травмы)	Да (хирургическое отделение для лечения травмы)	Нет	Ректальная колонизация	Настоящее исследование
12	E. cloacae S629	27	M	1/2011	Эквадор (госпитализация в реанимационное и хирургическое отделения после травмы)	Да (хирургическое отделение для лечения травмы)	Нет	Флегмона (рана бедра)	Настоящее исследование

^aM -мужчина; F -женщина.

^bДата возвращения в провинцию Альберта. Всем пациентам во время пребывания в зарубежных клиниках применяли антибиотики.

^cИМП – инфекции мочевыводящих путей.

У K. pneumoniae выявляли гены, ассоциированные с вирулентностью, в ПЦ которую проводили по ранее описанному Brisse et al. методу (37). Этими генами были: uge (кодирует уридиндифосфат галактоуронат 4-эпимеразу), wabG (принимает участие в биосинтезе липополисахарида наружной мембраны, ureA (ассоциирован с уреазным опероном), magA (ген А, ассоциированный с мукоидным фенотипом бактерии), mrkD адгезивные фимбрии типа 3), allS (активатор аллантоинового регулона), kfuBC (система захвата железа), rpmA (регулятор мукоидного фенотипа) и fimH (адгезивные фимбрии типа 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пациенты и бактерии. В течение 3-летнего периода (с апреля 2010 г. по апрель 2013 г.) выделили 17 штаммов бактерий, продуцирующих карбапенемазы, от 12 пациентов, совершивших в предшествовавший обследованию период поездку за пределы Канады. Детальная информация о пациентах (включая данные о симптоматике их патологий и странах, в которых они пребывали) представлена в таблице 1. Большая часть из них (n = 9) ездила в Индию, по 1 человеку совершили поездку в Грецию, Израиль и Эквадор. У большей части пациентов диагностировали инфекции мочевыводящих путей (ИМП). Каждому из них во время поездки за рубеж оказывалась медицинская помощь, причем 10 человек повторно госпитализировали в течение 7 дн после возвращения в провинцию Альберта в местные клиники. В 1 случае зарегистрировали вторичную передачу инфекции другому пациенту, находившемуся в том же отделении лечебного учреждения, повлекшую за собой его смерть (15).

Выделили 17 культур продуцирующих карбапенемазы бактерий: K. pneumoniae(n = 9), E. coli(n = 4), и по одной Enterobacter cloacae, Citrobacte rfreundii, Providencia rettgeri иA. baumannii (Таблица 1). Они все оказались нечувствительными (промежуточный уровень резистентности или резистентность) к AMC, TZP, FOX, CRO, CAZ, ATM, IPM, MER, ERT, CIP иSXT; 14 (82%) признали нечувствительными к GEN, 15 (88%) к TOB, 11 (65%) к AMK и 3 (18%) кTIM. Все штаммы проявляли чувствительность к CST.

Культуры, выделенные при активном скрининге. Клинические микробиологические лаборатории в Эдмонтоне и Калгари в течение 3-летнего периода исследовали 557 проб клинического материала, полученного от 227 пациентов, выделив продуцентов карбапенемаз в 1,1% случаев. Этой работой и организацией мер по недопущению дальнейшего распространения опасных инфекций руководили в каждом центре экстренной медицинской помощи Департаменты профилактики и контроля инфекций Эдмонтона и Калгари.

Бета-лактамазы. Большая часть выделенных штаммов (n = 10) энтеробактерий дала положительную реакцию в тесте «клеверного листа», проводившегося с применением MEM. С помощью комбинированных с ингибиторами (двойных) дисков Mastdiscs ID установили, что 12 штаммов образовывали металло-бета-лактамазы (МБЛ), а 4 – карбапенемазы класса A. У штамма A.baumannii образование карбапенемазы установили с помощью MBLE-теста и модифицированного теста «клеверного листа», проведенного с использованием IPM в качестве субстрата. Результаты ПЦР показали, что тестируемые культуры энтеробактерий имеют гены bla_KPC, bla_NDM,bla_CTX_-_M, bla_SHV,bla_TEM,bla_CMY, andbla_OXA_-48-_like, а секвенированием у них также выявили гены bla_TEM(TEM-1), bla_KPC.(KPC-2 или KPC-3), bla_NDM(NDM-1), bla_CTX_-_M(CTX-M-15), bla_SHV(SHV-12), bla_CMY(CMY-16)иbla_48-подобный (OXA-181) (детали приведены в таблице 2). У штамма A.baumanniiв ПЦР обнаружили гены bla_OXA_-23-_likeиbla_OXA_-51, а секвенированием выявили ген blaoxA-23-подобный(OXA-23) (Табл. 2).

ТАБЛИЦА 2 Молекулярная характеристика бактерий с карбапенемазами

					Плазмидные гены bla_НDM-1 или bla_KPC
Выделенные культуры	МЛСТ	ß-лактамазы	16S РНК метилаза(ы)	Детерминанты PMQR^a	Размер (тыс. пар оснований)	Тип репликона	Аддикционная(ые) система(ы)	ISAba125	^ble_MBL	Изоформа Tn4401
K. pneumoniae KpCG01	ST340	НПM-1, SHV-12, CTX-M-15, TEM-1	armA, rmtC	aac(6')-Ib-cr	150	FIIk	ccdA/B	+	+	НП^c
K. pneumoniae НТ11-19	ST147	НПM-1, CTX-M-15, TEM-1, OXA-30	rmtF	aac(6')-Ib-cr, qnrB	120	L/M	pemK, vagC/D	+	^—	НП
K. pneumoniae KpCG02	ST258	KPC-2, SHV-12, TEM-1	отриц.	отриц.	120	FIIk	vagC/D	НП	НП	a
K. pneumoniae KpCG03	ST147	KPC-2, TEM-1	armA	aac(6')-Ib-cr, qnrB	110	FIIk	vagC/D	НП	НП	b
K. pneumoniae RN12-59	ST15	НПM-1, CTX-M-15, CMY-16, TEM-1	rmtC, rmfF	qnrS	150	A/C	pemK, srnB/C	+	+	НП
K. pneumoniae KP01	ST972	НПM-1, CTX-M-15, OXA-181, TEM-1	rmtF	aac(6')-Ib-cr, qnrS	150	НТ^e	vagC/D	+	+	НП
K. pneumoniae KP02	ST16	НПM-1, CTX-M-15, TEM-1	rmtF	aac(6')-Ib-cr, qnrB	120	FIIk	pemK	+	—	НП
K. pneumoniae KPY18268	ST147	НПM-1, CTX-M-15, OXA-181, TEM-1	armA, rmtF	qnrB	180	A/C	vagC/D	+	+	НП
K. pneumoniae M2800	ST512	KPC-3, TEM-1	armA	отриц.	110	FIIk	vagC/D	НП	НП	a
E. coli MH01	ST101	НПM-1, CTX-M-15, TEM-1	armA, rmtC	отриц.	80	A/C	pemK, ccdA/B, vagC/D	+	+	НП
E. coli RN12-40	ST365	НПM-1, CTX-M-15, TEM-1	rmtC, rmtF	отриц.	180	A/C	pemK, relE, Hok/Sok	+	+	НП
E. coli RN12-50	ST405	НПM-1, CTX-M-15, CMY-16, TEM-1	rmtC, rmtF	qnrS	150	A/C	pemK, srnB/C	+	+	НП
E. coli EC01	ST410	НПM-1, CTX-M-15, TEM-1	rmtF	aac(6')-Ib-cr	80	A/C	pemK, vagC/D, Hok/Sok	+	—	НП
C. freuНПii НТ11-22	НП	НПM-1, CTX-M-15, OXA-30, TEM-1	rmtB, rmtC	aac(6')-Ib-cr, qnrB	180	A/C	vagC/D	+	+	НП
P. rettgeri UR53778	НП	НПM-1, TEM-1	armA, rmtF	qnrB	90	T	Neg	+	+	НП
E. cloacae S629	НП	KPC-2, TEM-1	отриц.	qnrA	120	L/M	ccdA/B	НП	НП	b
A. baumannii	ST10	OXA-23, OXA-51-like	armA	aac(6')-Ib-cr	НП	НП	НП	НП	НП	НП
AB01

^aPMQR – плазмидо-ассоциированные детерминанты резистентности к хинолонам.

^bСистемы аддикции;pemKI –поддержка распространения плазмиды; ccdA/B –локус деления соединившихся клеток; relE –ослабление контроля синтеза стабильной РНК; parD/EиvagC/D – протеины, ассоциированные с проявлением вирулентности; Hok/Sok, pndA/CиsrnB/C –плазмидные регуляторные системы минус РНК

^cНП – не проводили

«—» отсутствует

^eНТ - нетипируемый.

Молекулярная характеристика. Культуры E.coli отнесли в МЛСТ к секвенс-типам ST101, ST365, ST405 иST410, K.pneumoniae- к ST15, ST16, ST147, ST258, ST340, ST512 и ST972 (табл. 2) и A.baumannii- к ST10. Данные о наличии у этих штаммов разных плазмидо-ассоциированных детерминант резистентности к хинолонам (16Sр РНК метилаз, ISABA125, ble_MBL(у продуцентов NDM) и различных изоформTn4401 (у продуцентов KPC) представлены в таблице 2.

Изучение плазмид. У энтеробактерий имеется несколько плазмид размером от 20 до 250 тыс. пар оснований. В конъюгационном тесте, проведенном со штаммом J53 E.coli, получили трансконъюганты с плазмидами размером 80-180 тыс. пар оснований (табл. 2). В процессе идентификации в ПЦР групп плазмидной несовместимости выявили различные комбинации генов bla_NDM-1,относящихся к типам IncA/C, IncL/M, IncF и нетипируемым, в то время, как гены bla_KPCs относились к типам IncF и IncL/M (табл. 2). Группа несовместимых генов IncF содержала репликон FIIk. Дополнительные факторы, ассоциированные с разными плазмидами, представлены в таблице 2.

Факторы вирулентности. Секвенс-типы ST147, ST258, ST340, ST512 и ST972 K.pneumoniae имели гены mrkD, fimH, uge, wabGиureA, а секвенс-типы ST15 и ST16 – гены kfuBCmrkD, fimH, uge, wabGиureA. Штаммы E.coli, относящиеся к секвенс-типам ST101 иST365, обладали генами fimH, hra, fyuA иuidA,к ST410 – генами fimH, hra, iutA, traTиuidA,кST405 – генами fimH, kpsIII, PAI, iutA, fyuA, ompT, kii, PapC, traTиuidA.

ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью воздушных и наземных транспортных средств теперь можно легко и быстро (в течение часов и суток) перемещаться по странам и континентам с туристическими целями, для получения медицинской помощи, по вопросам бизнеса, для обучения, иммиграции, в поисках убежища (беженцы) или временной работы за рубежом. Вышедшие в последнее время публикации дают основания считать такие поездки фактором риска заражения антибиотикорезистентными микроорганизмами, в т.ч. штаммами E.coli, продуцирующими CTX-M,а также другими грамотрицательными бактериями, образующими карбапенемазы, в т.ч.относящимися к группам NDM и KPC (38). Мы привели характеристику обнаруженных в провинции Альберта в течение 3-летнего периода пациентов,заразившихся грамотрицательными бактериями-продуцентами карбапенемаз во время пребывания за пределами Канады. Полученные нами результаты показали, что штаммы K.pneumonia, образующие карбапенемазы NDM и относящиеся к разным секвенс-типам с раличным набором плазмид, регулярно заносятся в провинцию Альберта (Канада) из Индии. Все пациенты, обследованные в ходе настоящего исследования, обращались за рубежом за медицинской помощью (в большинстве случаев из-за ИМП) и были госпитализированы в течение нескольких недель после возвращения в провинцию Альберта (табл. 1). К счастью, вторичная передача инфекции продуцирующего карбапенемазу OXA-23 штамма A.baumannii произошла только 1 раз, но этот инцидент имел тяжелые последствия – заразившийся пациент умер (15). В течение 3-летнего периода мы также выделили продуцирующие карбапенемазы VIM и GES штаммы P.aeruginosa (12 случаев), и, кроме того, образующие карбапенемазы SME штаммы Serratiamarcescens(4 случая), инфекция которых не была связана с госпитализацией за рубежом. В 2003-2004 г. в Калгари регистрировали вспышки госпитальной инфекции, вызванные продуцирующими карбапенемазы VIM штаммами P.aeruginosa (39).

Ранее сообщалось о результатах аналогичного исследования, проведенного в Финляндии (40). В течение 4-летнего периода (2008-2011 гг.) у 25 пациентов, совершивших поездку за пределы Финляндии (преимущественно в Грецию) выявили карбапенемазо-продуцирущие энтеробактерии. Поскольку штаммы K.pneumoniaeс карбапенемазами KPC и VIM эндемичны для Греции (41), не вызывает удивления тот факт, что в 7 из 18 (39%) зарегистрированных случаев заражения за рубежом от пациентов выделили секвенс-типы ST258 и ST147 K.pneumoniaeс этими двумя группами карбапенемаз (KPC и VIM)(40). Продуцирующие NDM бактерии финские коллеги обнаруживали редко.

В провинции Альберта проживает большое количество репатриантов с Индийского субконтинента, они регулярно навещают своих друзей и семьи, оставшиеся на родине¹. Некоторые пациенты (4/12), описанные в упомянутой работе были выходцами из Восточной Индии. Для Индийского субконтинента NDM-продуцирующие бактерии эндемичны (5), что объясняет, почему в нашем исследовании так часто выделяли бактерии с этой группой карбапенемаз. Молекулярные характеристики таких штаммов (наличие CTX-M-15, aac(6’)-Ib-crи ряда РНК-метилаз, включая недавно описанные rmtF, ISABA125,ble_MBLи IncF или IncA/C плазмиды) весьма сходны с теми, которые ранее были описаны у NDM-продуцирующих энтеробактерий, обнаруженных у лиц, которые посещали Индийский субконтинент (6, 30). Мы описали плазмиды с узким (IncF) и широким (IncA/C) кругом хозяев и различными дополнительными факторами, ассоциированными с геном bla_NDM_-1. Это подтверждает результаты других исследований, свидетельствующих о том, что наблюдаемое в настоящее время распространение бактерий с карбапенемазами NDM не связано с одним типом плазмид или доминантными секвенс-типами бактерий.

В собранной нами коллекции бактерий с карбапенемазами (табл. 2), выделенными от выезжавших за рубеж пациентов, посредством МЛСТ идентифицировали ряд клонов с высоким эпидемическим потенциалом, таких как E.coli ST405, K.pneumoniae ST147 иK.pneumoniae ST258. Межконтинентальное распространение клона ST258 обусловлено частой встречаемостью по всему миру продуцирующих KPC штаммов K.pneumoniae( 11), в то время, как клон K. pneumoniae ST147 является новым секвенс-типом бактерии, ассоциированным с карбапенемазамиVIM (42-44), KPC и NDM (16). При сравнении факторов вирулентности различных секвенс-типов K. pneumoniaeнам не удалось установить факторы, ответственные за успешное международное распространение секвенс-типов ST258 иST147.

E.coli ST405 с разными карбапенемазами CTX-M распространены по всему миру (45), и недавно в Дании выделили штамм бактерии, образующий NDM-4, от пациента незадолго до этого находившегося в госпитале Вьетнама (46). Интересно отметить, что клон E.coli ST405 обладает значительно большим числом факторов вирулентности по сравнению с клонами ST101, ST365 и ST410. Истинная роль, которую играют факторы вирулентности экстраинтестинальных штаммов E.coli, не известна, и кажется маловероятным, что только один набор таких факторов служит их детерминантами вирулентности (47). Однако,нами ранее установлено, что такие факторы, как sat, iutA, malX, usp, iha, hra и ompT, могли бы иметь большое значение для диссеминации и экологического успеха клона ST405 (48).

Европейский центр профилактики и контроля болезней разработал коммуникационную платформу, предназначенную для контроля резистентности к антимикробным препаратам бактерий, ассоциированных с инфекциями, распространяющимися при оказании медицинской помощи: ее назвали «Эпидемиологической оперативной информационной системой» (EPIS) AMR-HAI. EPISAMR-HAI позволяет экспертам организаций стран ЕС, занимающихся оценкой рисков национального масштаба, быстро и безопасно обмениваться информацией о микроорганизмах с новыми факторами антибиотикорезистентности, которые могут представлять потенциальную опасность для ЕС (38). Мы рекомендуем создать аналогичные коммуникационные платформы в разных провинциях и штатах Северной Америки, которые позволили бы служащим медицинских учреждений, специалистам, занимающимся контролем инфекций и клиническим микробиологам своевременно обмениваться информацией о появлении штаммов бактерий с опасными механизмами антибиотикорезистентности.

Для предотвращения заноса и распространения мультирезистентных бактерий лицами, возвращающимися на родину после прохождения лечения в зарубежных медицинских учреждениях, необходимо сразу же их изолировать и быстро выявить тех из них, которые колонизированы или инфицированны такими штаммами бактерий (15,38,49). Скрининг людей, контактировавших с лицами, у которых обнаружили продуцентов карбапенемаз, представляется необходимым компонентом системы выявления бессимптомных носителей, инфицированных или колонизированных последними. Тех, у которых обнаружили продуцентов карбапенемаз, следует помещать в условия, в которых предотвращается дальнейшее распространение этих опасных штаммов. Принесет ли дополнительную пользу активный скрининг таких пациентов в период госпитализации зависит от частоты носительства у поступающих в медицинское учреждение лиц, а необходимость его рутинного скрининга неоднозначна по ряду причин, включая финансовый аспект.

Мы считаем, что распространение инфекций грамотрицательных бактерий с карбапенемазами должно тщательно контролироваться и что обнаружение таких бактерий клиническими лабораториями является важнейшим этапом, необходимым для оказания эффективной помощи пациентам, профилактики дальнейшего распространения и контроля инфекций. Мы рекомендуем пациентов, которые были госпитализированы в странах, эндемичных в отношении бактерий с карбапенемазами, в течение определенного срока (например, 6 мес) до возвращения на родину, подвергать карантинированию для избежания контактов с окружающими, и уделения ими особого внимания общим мерам контроля инфекций (например, гигиене рук, чистке средств совместного пользования и других объектов окружающей среды).

БЛАГОДАРНОСТИ

Проведение этой работы было поддержано исследовательским грантом Лабораторной службы Калгари (10006465).

J.D.D.P. получил финансовую поддержку на проведение исследований от компаний Мерк и АстраЗенека. Другие авторы не имеют возражений в отношении публикуемых материалов.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Paterson DL. 2006. Resistance in Gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. Am. J. Infect. Control 34 (5 Suppl1):S20–S28;discussion S64–S73. http://dx.doi.org/10.1016/j.ajic.2006.05.238

2. Livermore DM, Woodford N. 2006. The β-lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. TrendsMicrobiol. 14: 413–420. http://dx.doi.org/10.1016/j.tim.2006.07.008

3. Nordmann P, Naas T,Poirel L. 2011. Globalspread of carbapenemase producing Enterobacteriaceae. Emerg. Infect.Dis. 17: 1791–1798. http://dx.doi.org/10.3201/eid1710.110655

4. Yong D, Toleman MA, Giske CG,Cho HS, Sundman K, Lee K, Walsh TR. 2009. Characterization of a new metallo-β-lactamasegene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type14 from India. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 5046–5054. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.00774-09

5. Johnson AP, Woodford N. 2013. Global spread of antibiotic resistance: the example of New Delhi metallo- β-lactamase(NDM)-mediated carbapenem resistance. J. Med. Microbiol. 62: 499–513. http://dx.doi.org/10 .1099/jmm.0.052555-0

6. Poirel L, Dorte tL, Bernabeu S, Nordmann P. 2011. Genetic features of bla _NDM-1 -positive Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother. 5403–5407. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.00585-11

7. Walsh TR,Weeks J, Livermore DM, Toleman MA. 2011. Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and it simpli- cations for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect. Dis. 11: 355–362. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(11) 70059-7

8. Walther-Rasmussen J, Hoiby N. 2007. Class A carbapenemases. J. Antimicrob. Chemother. 60: 470–482. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkm226

9. Queenan AM, Bush K. 2007. Carbapenemases: theversatile β-lactamases.Clin.Microbiol.Rev. 20: 440–458. http://dx.doi.org/10.1128/CMR .00001-07

10. Deshpande LM, Rhomberg PR, Sader HS, Jones RN. 2006. Emergence of serine carbapenemases (KPC and SME) among clinical strains of Enterobacteriaceae isolated in the United States Medical Centers: report from the MYSTIC Program (1999–2005).Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 56: 367–372. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2006.07.004

11. Nordmann P,CuzonG,NaasT. 2009. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producingbacteria. Lancet Infect. Dis. 9: 228–236. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(09)70054-4

12. Health PHSo A. 2013. Carbapenem-resistant organisms. Government of Alberta, Alberta, Canada. http://www.health.alberta.ca/documents/Guidelines-Carbapenem-Resistant-Organisms-2013.pdf

13. Peirano G, Ahmed-Bentley J, Fuller J, Rubin JE, Pitout JDD. 2013. Abstr. 53rd Intersci.Conf. Antimicrob. Agents Chemother., abstrC2-905.

14. Peirano G, Ahmed-Bentley J, Woodford N,Pitout JD. 2011.New Delhi metallo-β-lactamase from traveler returning to Canada. Emerg.Infect. Dis. 17: 240–242. http://dx.doi.org/10.3201/eid1702.101313

15. Ahmed-Bentley J, Chandran AU, Joffe AM, French D, Peirano G, PitoutJD. 2013.Grame-negative bacteria that produce carbapenemases causing death attributed to recent foreign hospitalization. Antimicrob. Agents Chemother. 57: 3085–3091. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.00297-13

16. Peirano G, Pillai DR, Pitondo-Silva A, Richardson D, Pitout JD. 2011. The characteristics of NDM-producing Klebsiella pneumoniae from Canada. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 71: 106–109. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2011.06.013

17. Chan WW, Peirano G, Smyth DJ, Pitout JD. 2013. The characteristics of Klebsiella pneumoniae that produce KPC-2 importedf rom Greece. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 75: 317–319. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2012.12.003

18. Centers for Disease Control and Prevention. 2012. CRE toolkit—guidance for the control of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA. http: //www.cdc.gov/hai/organisms/cre/cre-toolkit/

19. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 22nd informational supple-ment. CLSA document M100-S22. Clinical and Laboratory Standards In-stitute, Wayne, PA.

20. Doyle D, Peirano G, Lascols C, Lloyd T, Church DL, Pitout JD. 2012. Laboratory detection of Enterobacteriaceae that produce carbapenemases. J. Clin. Microbiol. 50: 3877–3880. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02117-12

21. Peirano G, van der Bij AK, Gregson DB, Pitout JD. 2012. Molecular epidemiology over an 11-year period (2000 to 2010) of extended-spectrum-β-lactamase-producing Escherichia coli causing bacteremia in a centralized Canadian region. J. Clin. Microbiol. 50: 294–299. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.06025-11

22. Poirel L, Bonnin RA, Nordmann P. 2012. Genetic features of the widespread plasmid coding for the carbapenemase OXA-48. Antimicrob. Agents Chemother. 56: 559–562. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.05289-11

23. Woodford N, Ellington MJ, Coelho JM, Turton JF, Ward ME, Brown S, Amyes SG, Livermore DM. 2006. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp .Int. J. Antimicrob. Agents 27: 351–353. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2006.01.004

24. Mataseje LF,Boyd DA, Willey BM, Prayitno N, Kreiswirth N,Gelosia A,Poutanen SM, Low DE, Jenkins SG, Katz K,Mulvey MR. 2011. Plasmid comparison and molecular analysis of Klebsiella pneumoniae bouring bla (KPC) from New York City and Toronto. J. Antimicrob. Chemother. 66: 1273–1277. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkr092

25. Cuzon G, Naas T, Truong H, Villegas MV, Wisell KT, Carmeli Y, Gales AC, Venezia SN, Quinn JP, Nordmann P. 2010. Worldwide diversity of Klebsiella pneumoniae that produce-β-lactamase blaKPC-2gene. Emerg. Infect.Dis. 16: 1349–1356. http://dx.doi.org/10.3201/eid1609.091389

26. Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm DF, Jacoby GA, Hooper DC. 2006. qnr prevalence in ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from the United States Antimicrob. Agents Chemother. 50:2872-2874. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.01647-05

27. Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby GA, Macielag M, Abbana tD, Park CH, Bush K, Hooper DC. 2006. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nat. Med. 12: 83–88. http://dx.doi.org/10.1038/nm1347

28. Yamane K, Wachino J, Suzuki S, Arakawa Y. 2008. Plasmid-mediated qepA gene among Escherichia coli clinical isolates from Japan. Antimicrob. Agents Chemother. 52: 1564–1566. http://dx.doi.org/10.1128/AAC .01137-07

29. Doi Y, Arakawa Y. 2007. 16S ribosoma lRNA methylation: emerging resistance mechanism again staminoglycosides. Clin. Infect. Dis. 45: 88- 94. http://dx.doi.org/10.1086/518605

30. Hidalgo L, Hopkins KL,Gutierrez B, Ovejero CM, Shukla S, Douthwaite S, Prasad KN, Woodford N, Gonzalez-Zorn B. 2013.Association of the novel aminoglycoside resistance determinant RmtF with NDM carbapenemase in Enterobacteriaceae isolated in India and the UK. J. Antimicrob. Chemother. 68: 1543–1550. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkt078

31. Diancourt L, Passet V, Verhoef J, Grimont PA, Brisse S. 2005.Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J. Clin.Microbiol. 43: 4178–4182. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.43.8.417 8-4182.2005

32. Boyd DA, Tyler S, Christianson S, McGeer A, Muller MP, Willey BM, Bryce E,Gardam M, Nordmann P,Mulvey MR. 2004.Complete nucleotide sequence of a 92-kilobase plasmid harboring the CTX-M-15 extended-spectrum-β-lactamase involved in an out break in long-term-care facilities in Toronto, Canada. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 3758–3764. http://dx.doi.org/10.1128/AAC.48.10.3758-3764.2004

33. Carattoli A, Bertini A, Villa L, Falbo V, Hopkins KL, Threlfall EJ. 2005. Identiﬁcation of plasmids by PCR-based replicon typing. J. Microbiol. Methods 63: 219–228. http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2005.03.018

34. Villa L, Garcia-Fernandez A, Fortini D, Carattoli A. 2010. Replicon sequence typing of IncF plasmids carrying virulence and resistance determinants. J. Antimicrob. Chemother. 65: 2518–2529. http://dx.doi.org/10 .1093/jac/dkq347

35. Mnif B,Vimont S, Boyd A, Bourit E, Picard B, Branger C, Denamur E, Arlet G. 2010. Molecular characterization of addiction systems of plasmids encoding extended-spectrum-β -lactamases in Escherichia coli . J. Antimicrob. Chemother. 65: 1599–1603. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkq181

36. Johnson JR, Menard M, Johnston B, Kuskowski MA, Nichol K,Zhanel GG. 2009. Epidemic clonal groups of Escherichia coli as a cause o antimicrobial-resistant urinary tract infections in Canada, 2002 to 2004. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 2733–2739. http://dx.doi.org/10.1128/AAC .00297-09

37. Brisse S, Fevre C, Passet V, Issenhuth-Jeanjean S, Tournebize R, Diancourt L, Grimont P. 2009. Virulent clones of Klebsiella pneumoniae identiﬁcation and evolutionary scenario based on genomic and phenotypic characterization. PLoS One 4: e4982. http://dx.doi.org/10.1371 /journal.pone.0004982

38. van der Bij AK, Pitout JD. 2012. The role of international travel in the worldwide spread of multiresistant Enterobacteriaceae .J. Antimicrob. Chemother. 67: 2090–2100. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dks214

39. Pitout JD, Chow BL, Gregson DB, Laupland KB, Elsayed S, Church DL. 2007. Molecular epidemiology of metallo-β-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa in the Calgary Health Region: emergence of VIM-2-producing isolates. J. Clin. Microbiol. 45: 294–298. http://dx.doi.org/10 .1128/JCM.01694-06

40. Osterblad M, Kirveskari J, Hakanen AJ, Tissari P, Vaara M, Jalava J. 2012. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Finland: the ﬁrst years (2008–11).J. Antimicrob. Chemother. 67: 2860–2864. http://dx.doi .org/10.1093/jac/dks299

41. Giakkoupi P, Papagiannitsis CC, Miriagou V, Pappa O, Polemis M, Tryﬁnopoulou K, Tzouvelekis LS, Vatopoulos AC. 2011. An update of the evolving epidemic of bla_KPC-2 -carrying Klebsiella pneumoniae in Greece (2009–10). J. Antimicrob. Chemother. 66: 1510–1513. http://dx .doi.org/10.1093/jac/dkr166

42. Papagiannitsis CC, Kotsakis SD, Petinaki E, Vatopoulos AC, Tzelepi E, Miriagou V, Tzouvelekis LS. 2011. Characterization of metallo-β-lactamase VIM-27, an A57S mutant of VIM-1 associated with pneumoniae ST147. Antimicrob. Agents Chemother. 55: 3570–3572. http: //dx.doi.org/10.1128/AAC.00238-11

43. Hasan CM, Turlej-Rogacka A, Vatopoulos AC, Giakkoupi P, Maatallah M,Giske CG. 2013. Dissemination of bla_VIM in Greece at the peak of the epidemic of 2005–2006: clonal expansion of Klebsiella pneumoniae clonal complex 147. Clin. Microbiol. Infect. 20: 34–37. http://dx.doi.org/10.1111 /1469-0691.12187

44. Loli A, Tzouvelekis LS, Tzelepi E, Carattoli A, Vatopoulos AC, Tassios PT,Miriagou V. 2006. Sources o fdiversity of carbapenem resistance levels in Klebsiella pneumoniae carrying bla_VIM-1. J. Antimicrob. Che mother. 58: 669–672. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkl302

45. Woodford N, Turton JF, Livermore DM. 2011. Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol. Rev. 35: 736–755. http://dx.doi.org /10.1111/j.1574-6976.2011.00268.x

46. Jakobsen L, Hammerum AM, Hansen F, Fuglsang-Damgaard D. 2013. An ST405NDM-4-producing Escherichia coli isolated from a Danish patient previously hospitalized in Vietnam. J. Antimicrob. Chemother. 69: 559–560. http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkt356

47. Dobrindt U. 2005. (Patho-) genomics of Escherichia coli . Int. J. Med. Microbiol. 295: 357–371. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijmm.2005.07.009

48. Van der Bij AK, Peirano G, Pitondo-Silva A, Pitout JD. 2012. The presence of genesen coding for different virulence factors in clonally related Escherichia coli that produce CTX-Ms. Diagn. Microbiol.Infect.Dis. 72: 297–302. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2011.12.011

49. Rogers BA, Aminzadeh Z, Hayashi Y, Paterson DL. 2011. Country-to-country transfer of patients and the risk of multiresistant bacterial infection. Clin.Infect.Dis. 53: 49–56. http://dx.doi.org/10.1093/cid/cir273