Оценка пригодности транспортной системы Copan ESwab для посева Bordetella pertussis из образцов, взятых из носоглотки детей

21.03.2013

James J. Dunn¹, Ann Croft², Victor Hodson², Mark A. Fisher^2,3

¹Детский медицинский центр Кука, Форт Ворт, Техас, ²Региональный и университетский патоморфолог, Солт Лейк Сити, Юта,

³Университет Юты, отдел патологии, Солт Лейк Сити, Юта

Краткое содержание

Освещение проблемы: Коклюш – высоко контагиозная, предотвращаемая вакцинацией респираторная инфекция, вызываемая бактерией Bordetella pertussis. Диагностика коклюша продвинулась вперёд с появлением тестов, основанных на методах амплификации нуклеиновых кислот, таких как ПЦР. Тем не менее, рекомендации центра по диагностике и контролю заболеваний (CDC – Center for Disease Control) включают в себя посев, особенно при вспышках заболевания. Коэффициент сохранения жизнеспособности B. pertussis при посеве обычно составляет от 12% до 60% по сравнению с выявлением возбудителя пи помощи ПЦР.

Методы: В данном исследовании была проведена оценка пригодности транспортной системы Copan ESwab для посева B. pertussis из образцов, взятых из носоглотки (NP – nasopharyngeal) 223 детей (средний возраст 3,3 года; медиана возраста 1,5 года). С помощью системы ESwab из носоглотки каждого пациента брали два образца, один из которых исследовался на наличие B. pertussis с помощью ПЦР в реальном времени, а второй был отправлен в специализированную лабораторию для посева на агар Регана-Лоу. Среднее время до ПЦР после взятия образцов составляло 18 ч, все транспортные системы ESwab до транспортировки хранились при 4°С. Среднее время с момента сбора образцов до посева составляло 50 ч (медиана 47ч).

Результаты: Из 76 образцов, собранных с помощью системы ESwab и транспортировавшихся при комнатной температуре, ПЦР выявила B. pertussis в 9 случаях, посев не выявил ни в одном случае, в 21% случае при посеве имел место чрезмерный рост плесневых грибов или грам-отрицательных палочек. Из 147 образцов, собранных с помощью системы ESwab и транспортировавшихся при 4°С, ПЦР выявила B. pertussis в 36 случаях, и из них 8 дали положительный результат на B. pertussis при посеве. В 6 случаях при положительном результате посева B. pertussis сохранял жизнеспособность в образцах, хранившихся при 4°С не менее 79 ч, а в трех образцах был обнаружен B. pertussis, сохранивший жизнеспособность не менее чем 5 дней. Чрезмерный рост плесневых грибов или грам-отрицательных палочек обнаружился в 10% образцов, транспортированных при 4°C. Средняя величина пороговой линии (Ct – crossing threshold) при ПЦР составляла для положительных образцов, собранных с помощью системы ESwab, 18,3, для отрицательных – 28,3.

Выводы: Как и в случае с другими транспортными системами, используемыми для выделения B. pertussis, чувствительность посева с использованием системы ESwab низка по сравнению с ПЦР, а жизнеспособность возбудителя может быть снижена из-за чрезмерного роста других организмов, мешающего развитию B. persussis. В настоящее время проводятся исследования по сравнению коэффициента жизнеспособности B. pertussis в образцах, взятых из носоглотки, при использовании системы ESwab и столбика с агаром Регана-Лоу в одних и тех же условиях транспортировки.

Материалы и методы

С помощью системы ESwab (Copan Diagnostics, Мурриета, Калифорния) у пациентов в двух повторностях были взяты мазки из носоглотки. Один мазок был использован для ПЦР-диагностики, а другой отослан в специализированную лабораторию для посева. Образцы были разделены на четыре группы (см. таблицу 1).

ПЦР в реальном времени

Амплификация и определение участка ДНК B. pertussis IS481 размером 114 пар нуклеотидов проводилось согласно описанному ранее протоколу (Hood et al.) с использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из 1 мл отцентрифугированного образца, собранного с помощью системы ESwab. Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем протеиназу K, и нагревали при 100°C в течение 10 минут. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с помощью станции Qiagen Biorobot EZ1 и набора для выделения ДНК из тканей, после чего проводили элюцию с помощью 60 мкл буфера для элюции. Десять мкл элюата добавляли к реакционной смеси, содержавшей смесь для ПЦР Taqman Universal PCR (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния), экзогенный внутренний контроль (Applied Biosystems), 900 мкМ смеси прямых и обратных праймеров и 300 мкМ зонда в общем реакционном объёме 50 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems) при следующих параметрах циклов: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, 45 циклов - 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Образцы со средней величиной пороговой линии < 35 считались положительными на B. pertussis.

Посев

Посев образцов из групп 1-3 проводился следующим образом:

Пробирки энергично встряхивали, инокулировали 50 мкл жидкости на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу (BD, Sparks, MD Hardy Diagnostics, Санта Мария, Калифорния) и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
Пересев проводили ежедневно в течение 5 дней по вышеуказанной методике.
Чашки инкубировали в течение 7 дней при 35°С в обычной атмосфере.
Чашки ежедневно учитывались, а результаты регистрировались.
Положительный результата посева подтверждали с помощью флуоресцентного окрашивания антителами к Bordiella pertussis (BD-Difco).

Посев образцов из группы 4 проводился следующим образом:

Пробирки энергично встряхивали, инокулировали 50 мкл жидкости на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
Пробирки ESwab центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин и удаляли большую часть супернатанта.
Осадок ресуспендировали, инокулировали 50 мкл на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
Материал из пробирок со столбиками агара Регана-Лоу (Hardy Diagnostics) инокулировали на чашки с агаром Регана-Лоу в двух повторностях и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
Чашки инкубировали в течение 7 дней при 35°С в обычной атмосфере.
Чашки ежедневно учитывались, а результаты регистрировались.
Положительный результата посева подтверждали с помощью флуоресцентного окрашивания антителами к Bordiella pertussis (BD-Difco).

Анализ данных

Статистический анализ был выполнен с использованием t-критерия Стьюдента, точного критерия Фишера или дисперсионного анализа с помощью программы GraphPad Prism v5 (GraphPad, Ла Джолла, Калифорния).

Результаты

Таблица 1. Описание категорий образцов.

Группа 1 (N=76)	ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные образцы	Транспортировка и хранение при комнатной температуре
Группа 2 (N=123)	ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные образцы	Транспортировка и хранение в холодильнике
Группа 3 (N=17)	ПЦР-положительные образцы	Транспортировка и хранение в холодильнике
Группа 4 (N=7)	ПЦР-положительные образцы Два образца – один хранился в системе ESwab, второй – на агаре Регана-Лоу	Транспортировка и хранение в холодильнике

Рисунок 1. Результаты ПЦР, посева и уровень контаминации. Для каждой категории образцов показано количество образцов, оказавшихся положительными при ПЦР и при посеве, а также образцов с контаминацией

Рисунок 2. Среднее время до посева и средние величины пороговой линии. Для каждой категории образцов показано среднее время от взятия образца до посева и средние величины пороговой линии при ПЦР

Рисунок 3. Пороговые линии результатов ПЦР. Для восьми образцов B. pertussis с положительным результатом посева среднее значение пороговой линии (Ct) при ПЦР составляло 18,3 ± 6,4. Для 28 образцов B. pertussis с отрицательным результатом посева и положительным при ПЦР среднее значение Ct составило 28,3 ± 4,6. Данное различие было статистически значимым при использовании t-критерия Стьюдента (p<0,001).

Обсуждение и выводы

Обсуждение

♦ Целью данного исследования было определение возможности использования системы ESwab в качестве альтернативы агару Регана-Лоу для поддержания жизнеспособности B. pertussis при транспортировке. Как и для других транспортных сред ранее, при использовании системы ESwab мы наблюдали низкие показатели положительного ответа при посеве на B. pertussis (18%).

♦ Образцы с более низкими значениями пороговой линии (показатель более высокой концентрации микроорганизмов) гораздо чаще давали положительный результат при посеве (p<0,001), чем образцы с высокими значениями (более низкая концентрация микроорганизмов), которые в основном давали отрицательный ответ. Образцов с положительным результатом посева и отрицательным результатом ПЦР не было.

• Между значениями пороговой линии для образцов, транспортировавшихся при комнатной температуре (все посевы отрицательны), и значениями для образцов с положительным результатом посева не было значительных различий, что свидетельствует о том, что транспортировка при комнатной температуре может отрицательно сказываться на жизнеспособности B. pertussis.

♦ Во многих культурах наблюдалась контаминация другими грам-отрицательными палочками или плесневыми грибами, что могло снизить жизнеспособность B. pertussis.

♦ Влияние температуры транспортировки на жизнеспособность B. pertussis сложно оценить, поскольку в большинстве культур микроорганизм не выжил. Тем не менее, средние значения Ct указывают на снижение жизнеспособности при комнатной температуре.

Температура транспортировки не влияла на контаминацию; чрезмерный рост чаще наблюдался в образцах, хранившихся при комнатной температуре, чем в образцах, хранившихся при охлаждении (p=0,0352)

♦ Для единственной пары посевов с положительным результатом из группы 4 транспортировка с помощью системы ESwab и агара Регана-Лоу дала равное количество колоний B. pertussis. Они транспортировались и хранились в одинаковых условиях и, по-видимому, одинаково были способны поддерживать жизнеспособность B. pertussis. В этой группе не удалось исследовать все образцы из-за снижения количества ПЦР-положительных образцов к концу срока исследования.

♦ Между длительностью транспортировки и сроком сохранения жизнеспособности B. pertussis прямой корреляции не было. Наиболее короткий срок транспортировки для образца с положительным результатом посева составлял 31 ч (Ct=14,5), а наиболее длинный – 62 ч (Ct=31,3). B. pertussis удалось выделить из этого последнего образца более чем через 6 дней с момента его получения. Повторные посевы со среды ESwab давали положительный результат до 5 дней (3,4 дня в среднем), за исключением двух образцов, посев которых был положительным лишь 1 день.

Выводы

Посев на B. pertussis обладает малой чувствительностью по сравнению с ПЦР. Успех посева может зависеть от таких факторов, как температура и срок транспортировки, концентрация микроорганизма и присутствие других микроорганизмов. В совокупности данные наблюдения свидетельствуют о том, что жизнеспособность B. pertussis после транспортировки образца с помощью системы ESwab может быть очень разной.

Из-за малого количества образцов, протестированных на обеих средах, необходимы дальнейшие исследования с целью достоверного сравнения способности системы ESwab и агара Регана-Лоу поддерживать жизнеспособность B. pertussis в процессе транспортировки.

Ссылки

Hood, J.L., J.J. Dunn, and D.K. Murphey. 2008. Outbreak of hospital acquired pertussis in newborn infants in Texas, 2004. Morbidity and Mortality Weekly Report 57(22):600-603.

Wendelboe, A.M. and A. Van Rie. 2006. Diagnosis of pertussis: a historical review and recent developments. Expert Rev. Mol. Diagn. 6(6):857-864.