Выявление эпидемиологически значимых организмов в контрольных образцах с использованием смешанных тампонов системы еСваб

20.12.2011

Европейский Конгресс клинической микробиологии инфекционным заболеваниям

2011

Выявление эпидемиологически значимых организмов в контрольных образцах с использованием смешанных тампонов системы еСваб; сравнение тампонов системы еСваб с тампонами из набора транспортной среды Эймса

Б.М. УИЛЛИ, П. ГНАНАСУНТАРАМ, Г. НГУЕН, Б. БОРГУНДВААГ, У. ЛЕУНГ, М. ЛОФТУС, Р. ТАНАБАЛАН, В. ПОРТЕР, Дж. СМОЛЛ, И. ЭДВАРДС, П. ЛО, К. ВОНГ, Ю. ВЕЙ, Г. МАЛИ, А. Дж. МАКГЕЕР, С.М. ПОУТАНЕН

Сеть здравоохранения университета/Больница Маунт-Синай, Университет Торонто, Торонто, провинция Онтарио

Обзор

Цели: Пилотное исследование, заключающееся в сравнении 254 отдельных тампонов системы еСваб с вискозными тампонами из набора транспортной среды Эймса (далее ТСЭ) для выявления метициллин-резистентного и метициллин-чувствительного золотистого стафилококка (MRSA, MSSA) в полости носа и подмышечных впадинах, показало, что числовое значение выделенных микроорганизмов на тампонах системы еСваб оказалось между значениями ТСЭ с прямым посевом и ТСЭ с обогащенной культурой бульона. В ходе данного исследования производилось сравнение количества микроорганизмов, взятых при использовании тампонов системы еСваб для смешанных назальных и ректальных мазков и взятых в виде отдельных тампонов из набора ТСЭ.

Методы: С августа по декабрь 2010 г. у пациентов отделения неотложной медицинской помощи и клиники, занимающейся лечением воспалительных заболеваний кишечника, были взяты отдельные назальные и ректальные мазки при помощи тампонов ТСЭ одновременно со смешанными мазками, взятыми тампонами системы еСваб. При этом этический комитет одобрил проведение данного исследования, а больные дали информационное согласие. Мазки ТСЭ были посеяны вручную в соответствии с лабораторным протоколом на селективный агар для выявления MRSA, MSSA, резистентных грамотрицательных бактерий (R GNB; определяемых, как приобретенная резистентность к цефалоспорину R третьего поколения плюс фторхинолонам и/или аминогликозиду) и ванкомицин-резистентных энтерококков (VRE). Автоматизированный прибор WASP (компании Копан) посеял 30 мкл жидкости, полученной с каждого вида смешанных мазков, выполненных тампонами системы еСваб, в те же четыре среды. Методы инкубации и идентификации были стандартизированы.

Результаты: Всего 475 пациентов дали согласие на одновременное взятие образцов. MRSA был выявлен у 7 пациентов, из которых 5 случаев (1,1%) были обнаружены после назального мазка ТСЭ, 4 (0,8%) - после ректального ТСЭ, 6 (1,3%) после парных мазков назального и ректального ТСЭ и 6 (1,3%) - после смешанного мазка еСваб. В связи с низким уровнем преобладания MRSA среди пациентов показателем для сравнения тампонов послужило выявление MSSA. MSSA был выявлен у 102 (21,5%) пациентов после назального мазка, у 37 (7,9%) после ректального, у 112 (23,6%) после парного, назального или ректального, в то время как 107 (22,5%) случаев было выявлено после смешанного мазка, из всех 118 случаев MSSA. Различие в общем количестве пациентов с MSSA, обнаруженным при использовании комбинированных мазков ТСЭ и смешанных мазков еСваб, не было статистически значимым (107 мазков еСваб MSSA+ и 112 мазков ATM MSSA+: точный критерий Фишера/двухсторонний, значение P=0,7079). Аналогично, не было статистического расхождения между выявлением резистентных грамотрицательных бактерий R GNB 2-мя системами мазков: и ректальные мазки, и смешанные мазки выявили 49 случаев R GNB, соответственно, среди 51 пациента с положительной реакцией. Среди 51 пациента с R GNB (1 с C. freundii, 42 с E. coli, 4 с K. pneumoniae, 4 с P.mirabilis) 47 случаев было выявлено при помощи ректальных и смешанных мазков одновременно, тогда как E. coli у 4 оставшихся пациентов была обнаружена только при помощи ректальных (у 2 пациентов) или смешанных мазков системы еСваб (у 2 пациентов). Ни один мазок не выявил наличия VRE.

Выводы: Данное исследование показало, что у смешанных мазков еСваб (назальных и ректальных), которые были посеяны при помощи прибора WASP, количество выделяемых, эпидемиологически значимых организмов совпадает с количеством микроорганизмов, полученных при назальных и ректальных мазках ТСЭ.

Введение

В связи с растущей трудоемкостью, связанной с контрольным обследованием на предмет выявления эпидемиологически значимых организмов (ЭЗО), в сочетании с ограничением бюджета, с которым столкнулось большинство лабораторий клинической микробиологии, появилась необходимость в автоматизации процесса обработки образцов. Более того, снижение затрат привело к тому, что многие институты стали брать смешанные мазки для минимизации расходов, несмотря на то, что ни одно исследование, сравнивающее степень восстановления ЭЗО из отдельных полученных мазков и из смешанных образцов для подтверждения данной практики проведено не было.

Для удовлетворения потребностей были разработаны разнообразные приборы для автоматического посева и штрихования. Это позволило освободить время персонала для выполнения других задач. Однако при внедрении таких систем, как WASP (Компания Копан Диагностикс) необходимо, чтобы лаборатории перешли от вискозных тампонов в полутвердой транспортной среде Эймса (ТСЭ) на флок-тампоны системы еСваб, состоящие из нейлонового волокна и транспортируемые в жидкой среде Эймса в стандартных пробирках с завинчивающейся крышкой.

В то время как предыдущие исследования показали, что флок-тампоны сравнимы с вискозными тампонами при анализе элементарных организмов, проспективные исследования, в частности, изучающие их эффективность при восстановлении микроорганизмов из контрольных мазков, не проводились. Летом 2010 г. среди пациентов с высоким показателем распространения было проведено контрольно-проверочное предварительное исследование. В ходе исследования шло проспективное сравнение 254 отдельных мазков системы еСваб, взятых одновременно с отдельными мазками ТСЭ (системы СтарСваб II, компания СтарПлекс Саентифик) из носовой полости и подмышечных впадин с целью определения эффективности системы еСваб при выявлении метициллин-чувствительного и метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA, MSSA). Результаты пилотной выборки показали, что числовое значение выделяемых MRSA и MSSA при использовании системы еСваб оказалось между значениями ТСЭ с прямым посевом и ТСЭ с обогащенной культурой бульона (данные не указаны).

Поскольку неотъемлемыми составляющими надежного восстановления ЭЗО являются безопасность пациента и инфекционный контроль, цель данного исследования заключалась в сравнении количества выделяемых микроорганизмов, полученных при помощи смешанных флок-тампонов автоматическим путем и при помощи вискозных тампонов ТСЭ, обработанных ручным способом для восстановления ЭЗО.

Методы и материалы

Источник и тип образца

С одобрения больницы Маунт-Синай и этического комитета университета Торонто, а также после получения информационного согласия пациентов отделения неотложной медицинской помощи и клиники, проводящей лечение воспалительных заболеваний кишечника, единичные назальные и ректальные мазки были получены при использовании вискозных тампонов ТСЭ (наборы СтарСваб II, Компания СтарПлекс) одновременно со взятием смешанных назальных и ректальных мазков при помощи тампонов системы еСваб, помещенных в отдельную стандартную пробирку, содержащую 1 мл модифицированной жидкости Эймса (двойной набор еСВАБ Компании Копан для выявления MRSA, см. последовательность инокуляции на Рисунке 1).

Рисунок 1. Использование двойного набора еСваб компании Копан для изучения ЭЗО: 1) после взятия мазка из кишечника (розовый цвет) мазок с флок-тампона высевают в жидкую среду Эймса, после чего тампон выкидывают; после взятия мазка из носовой полости (белый цвет) флок-тампон помещают в пробирку, надломленную в области насечки, и крышка плотно ввинчивается в пробку для предотвращения утечки. На смешанные мазки системы еСваб наклеивают этикетки с обозначениями и отправляют в лабораторию для обработки при помощи прибора WASP.

Период исследования и количество образцов, взятых параллельно

Образцы были взяты в период с августа по декабрь 2010 г. у 475 пациентов отделения неотложной медицинской помощи и клиники, проводящей лечение воспалительных заболеваний кишечника. Это составило 475 смешанных мазков, взятых при помощи системы еСваб, включающих ректальные и назальные образцы, и 475 мазков ТСЭ каждого вида из носовой полости и кишечника; что в целом составило 1425 образцов (Таблица 1).

Таблица 1: Обзор изученных мазков, взятых у 475 пациентов, и способ посева

Источник контрольных мазков	Место взятия мазка	Смешанные мазки, взятые при помощи системы еСваб	Вискозные тампоны ТСЭ	Способ посева в соответствии с типом микроорганизмов
Отделения медицинской помощи	Назальные	102	102	MSSA>MRSA
Отделения медицинской помощи	Ректальные	102	102	MSSA>MRSA> ESBL>VRE
Клиника по лечению воспалительных заболеваний кишечника	Назальные	373	373	MSSA>MRSA
Клиника по лечению воспалительных заболеваний кишечника	Ректальные	373	373	MSSA>MRSA> ESBL>VRE
Общее число образцов	1425	475	950

Учет материалов и методов

Обработка образцов

Мазки ТСЭ были посеяны ручным способом на хромогенный агарMSSA, на хромогенный агар (компании Оксоид) с темно-синим окрашиванием для определения MRSA, на агар бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) для выявления бактерий R-GNB (компания Оксоид), определяемых как приобретенная резистентность к цефалоспорину R третьего поколения плюс фторхинолонам или аминогликозиду, а также на ванкомицин м-агар для энтероккоков (компании Дифко), приготовленный в амбулаторных условиях для выявления ванкомицин-резистентных энтерококков (VRE).(компании Оксоид) длястафилококков с целью выявления

Посев ручным методом состоял в том, что мазок с каждого кончика тампона был нанесен на поверхность пластины круговым движением, образуя окружность с диаметром 3 см.

Селективные агары были засеяны в точно таком же порядке, как указано выше в Таблице 1. За этим последовало автоматизированное штрихование каждого посева прибором ИзоПлейтер.

Смешанные мазки, взятые тампонами системы еСваб, были помещены в загрузочный лоток автоматизированного прибора WASP для посева (Рисунок 2.). Всего 30 мкл жидкости с каждого тампона системы еСваб было инокулировано в той же среде постепенно. При инокуляции с использованием прибора WASP порядок не соблюдался, так как петля прибора стерилизовалась между посевами, а также до и после штрихования каждого посева.

Инкубация штрихованных посевов в условиях окружающей среды при температуре 37°C в обеих группах изучения происходила одновременно, а методы, применяемые для исследования позитивных культур микроорганизмов из всех сред, были стандартизированы в соответствии с лабораторными протоколами.

Рисунок 2. Когда в лабораторию поступают двойные мазки системы еСваб произовдства компании Копан для проведения инокуляции, прибор WASP автоматически обозначает подходящую среду, указанную в тестовых данных, заключенных в штрих-коде пациента на пробирке.

Данный прибор развинчивает крышку, удаляет тампон, высеивает в 30 мкл петлю с жидкостью модифицированную среду Эймса, содержащую элюированный материал смешанных образцов для каждой среды, и наносит штрихование на посевной материал для получения отдельной колонии. В ходе данного исследования аппарат WASP последовательно осуществил посев элюированных образцов на 4 селективных агара для определения MSSA, MRSA, R-GNB и VRE, соответственно.

Результаты

Общее число ЭЗО, выявленных из 1425 образцов, отслеженных в ходе исследования, указано в Таблице 2.

Таблица 2: Сводная информация о содержании ЭЗО согласно результатам, полученным в ходе обследования 475 пациентов с применением двух разных типов тампонов (№.)

Тип тампона	Общее число	MSSA+	MRSA+	R-GNB+	VRE+
Смешанные назальные/ректальные образцы, взятые при помощи двойного набора еСваб компании Копан	475	107	6	49	0
Ректальные мазки, взятые вискозными тампонами ТСЭ из набора СтарПлекс II	475	37	4	49	0
Назальные мазки, взятые вискозными тампонами ТСЭ из набора СтарПлекс II	475	102	5	*	*
Общее количество случаев MSSA/MRSA, обнаруженных при анализе назальных и ректальных мазков, взятых вискозными тампонами ТСЭ	475	112	6	*	*
Общее количество случаев выявления ЭЗО при использовании всех типов тампонов (т.е. общее число пациентов)	475	118	7	51	0
Общее количество тампонов с положительной реакцией на ЭЗО /Общее число протестированных тампонов	1425	246/1425	16/1425	98/950*	0/950*

*Назальные мазки не обрабатывались для выявления R-GNB или VRE.

Метициллин-чувствительный золотистый стафилококк (MSSA)

В связи с низким показателем распространения MRSA среди амбулаторных больных, участвовавших в исследовании, сравнение типов тампонов осуществлялось с помощью выявления MSSA в качестве показателя обнаружения MRSA.

В целом, MSSA был выявлен всего у 118 пациентов (Таблица 2). Среди них, у 102 (21,5%) пациентов MSSA был обнаружен при назальном мазке ТСЭ, у 37 (7,9%) – при ректальном, в целом, 112 (23,6%) случаев были выявлены одновременно при назальном и ректальном мазке ТСЭ, в то время как MSSA был обнаружен у 107 (22,5%) пациентов при взятии мазков смешанными тампонами системы еСваб.

Расхождение в общем числе пациентов с MSSA, выявленное при использовании парных вискозных тампонов ТСЭ, при сравнении со смешанными тампонами системы еСваб не было статистически значимым: у 107 мазков, взятых тампонами системы еСваб, была обнаружена положительная реакция на MSSA по сравнению со 112 образцами, где, по крайней мере, одна сторона из парных вискозных тампонов ТСЭ показала положительную реакцию (точный критерий Фишера/двухсторонний, значение P =0,7079).

Таблица 3: Сравнение роста показателей MRSA, выявленного у обоих типов тампонов в ходе исследования

№ MRSA	Смешанные тампоны системы еСваб	Назальные тампоны среды Эймса	Ректальные тампоны среды Эймса
1	0	0; +++ обогащение бульона*	0
2	+++	+++	0
3	+/-	+	0
4	+/-	1 колония	+
5	++	0	+++
6	+	++	5 колоний
7	+++	+/-	1 колония

*Назальные и ректальные мазки, взятые вискозными тампонами ТСЭ, в единичном случае были автоматическим способом посеяны при помощи обогащенного бульона, так как было известно, что пациент является носителем MRSA. Прямой посев мазков, взятых вискозным тампоном и тампоном системы еСваб у данного пациента, не помог вырастить колонию MRSA, однако у обогащенного назального мазка, полученного при помощи тампона, была положительная реакция.

Подсчет результатов

Метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA)

Из 475 пациентов, согласившихся на проведение одновременного изучения образцов, MRSA был обнаружен у 7 (1,5%; Таблица 2). Из них у 5 (1,1%) отдельных пациентов он был выявлен после назальных мазков ТСЭ, у 4 (0,8%) – после ректальных. Всего обнаружено 6 (1,3%) случаев, когда результаты парных назальных/ректальных мазков ТСЭ, взятых у одного пациента, совпадали. Аналогично, MRSA был выявлен у 6 (1,3%) пациентов при использовании смешанных тампонов системы еСваб. При объединении данных, полученных при использовании обоих типов тампонов, было обнаружено всего 7 случаев MRSA.

Рост микроорганизмов, отличных от золотистого стафилококка, на селективных агарах MSSA и MRSA

Число отличных от MSSA и MRSA культур, полученных при ректальных и назальных мазках, сравнили с числом микроорганизмов, полученных при смешанном мазке, взятом тампоном системы еСваб. Это было сделано с целью определения различия в бактериальной осеменённости и её потенциального эффекта на восстановление ЭЗО (Таблица 4).

Таблица 4: Суммарное значение микроорганизмов, отличных от золотистого стафилококка*, полученных при помощи мазков ТСЭ и смешанных мазков, взятых тампонами системы еСваб (№. %)

Тип мазка	Общее число	Рост других микроорганизмов на селективном агаре MSSA	Рост других микроорганизмов на селективном агаре MRSA
Смешанные ректальные и назальные мазки (еСваб)	475	352 (74,1)	75 (15,8)
Ректальные мазки (вискозные тампоны ТСЭ )	475	345 (72,6)	33 (7)
Назальные мазки (вискозные тампоны ТСЭ )	475	270 (56,8)	6 (1,3)
Мазки с парных тампонов ТСЭ	950	615 (64,7)	39 (4,1)

*Включают колонии цветов, отличающиеся от темно-синего (обе среды); могут действовать или бездействовать, могут перерасти остальные ЭЗО.

Резистентные грамотрицательные бактерии (R-GNB)

Таблица 5 описывает многообразие R-GNB и расхождение между ректальными мазками ТСЭ и смешанными мазками еСваб, обнаруженное при обследовании 475 пациентов. Одни и те же 49 различных бактерий R-GNB были обнаружены у параллельных образцов, полученных от 47 пациентов, тогда как 4 других R-GNB были выявлены только при одном типе взятия мазков: 2 при мазке ТСЭ и 2 при смешанных мазках еСваб. В результате этого, всего у 51 (10,7%) пациента обнаружены бактерии R-GNB.

Как и в случае со стафилококком, статистического расхождения в возможности обнаружения бактерий R-GNB среди 2 типов тампонов выявлено не было, однако была заметна интенсивность роста между 2 типами тампонов. Количество выделяемых микроорганизмов было равным в 26/51 случаях позитивной реакции, плюс 1 реакция при использовании тампонов еСваб у 14 пациентов, еще 2 реакции при использовании системы еСваб у 5 пациентов, в то время как при использовании ТСЭ произошел только 1 случай роста у 4 и 2 крупных случая роста у 1 образца. Во всех 4 случаях несовпадения образцов интенсивность позитивного роста микроорганизмов составила меньше1+.

Таблица 5: Виды и профиль резистентности, связанные с R-GNB, обнаруженными на 2 типах тампонов

Виды выделенных R-GNB	ESBL класса А	Класс C (амп C)'	Индуци-рованный Класс С	CIP-R***	GM-R****	Тампоны ТСЭ и тампоны системы еСваб для смешанных мазков	Только вискозные тампоны ТСЭ +	Только тампоны для смешан-ных мазков системы еСваб +
C. freundii	-	-	+	+	-	1
E. coli	+	-	-	-	-	5
	+	-	-	+	-	7	1	1
	+	-	-	-	+	1
	+	-	-	+	+	3
	+	+	-	-	-	4
	+	+	-	+	+	2
	-	+	-	-	-	11	1
	-	+	-	+	-	4		1
	-	+	-	-	+	2
	-	-	-	+	-	1
K. pneumoniae	+	-	-	+	-	1
	+	-	-	+	+	1
	-	+	-	+	-	1
	-		+	-	-	1
P. mirabilis	+		-	+	+	1
P. mirabilis		+	-	-	-	3

Класс C (амп C) бета-лактамаза, вызывающая резистентность к oxyimino cepha osporins

** Индуцированный класс С - бета-лактамаза присутствует в C freundii, но и в среде DHA-1 в K. pneumoniae

***CIP-R ципрофлоксацин-резистентный

**** GM-R гентамицин-резистентный

Ванкомицинорезистентные энтерококки (VRE)

VRE не были выявлены ни в одном мазке, обработанном в ходе исследования. Данный результат не удивляет, так как VRE обычно встречаются в больничных стенах, а пациенты, принявшие участие в обследовании, были в основном амбулаторными.

Выводы и комментарии

При работе со стафилококками и R-GNB посеянные прибором WASP смешанные назальные и ректальные мазки, взятые тампонами системы еСваб, выявили статистически равное число пациентов с ЭЗО. То же самое показали назальные и ректальные образцы, полученные и посеянные отдельно, с использованием вискозных тампонов ТСЭ. В связи с недостаточным количеством случаев положительной реакции среди обследованных пациентов в ходе исследования не удалось установить, соблюдалось ли данное равенство в случае с VRE.

Несмотря на то, что чрезмерный рост ЭЗО за счет микроорганизмов симбиотической флоры возможен вследствие совмещения ректальных мазков с назальными, а также вследствие тестирования большего объема образцов тампонов системы еСваб (30 мкл по сравнению с прямым вращением тампона ТСЭ), данные, полученные в ходе исследования, не позволяют сделать заключение по данному вопросу.

В заключение, данные, полученные в ходе исследования, показывают, что на процент выявления ЭЗО не окажет негативного влияния переход от мазков, взятых отдельными вискозными тампонами ТСЭ, к смешанным назальным и ректальным мазкам, взятым тампонами системы еСваб и посеянным автоматизированной системой WASP.

Благодарность: Тампоны набора СтарСваб II ТСЭ для данного и пилотного исследований были предоставлены Сьюзан Финн из компании СтарПлекс Саентифик; среды, использованные в ходе данного и пилотного исследований, были предоставлены Брайаном Кемпом из компании Оксоид; материалы для прибора WASP/системы еСваб были предоставлены компанией «Копан» (Копан). И мы, несомненно, выражаем нашу благодарность всему техническому персоналу больницы Маунт-Синай, который с радостью установил систему еСваб на оборудование WASP, а также благодарим сотрудников отделения оказания медицинской помощи вышеупомянутой больницы за то, что они потратили время на получение информационного согласия и дополнительных образцов!