Мюллер-Хинтон агар

Мюллер-Хинтон агар 

Mueller-Hinton Agar

Также известно, как M-H Agar

Назначение

Среда рекомендована для определения чувствительности патогенных микроорганизмов к антибиотикам и сульфаниламидам Кирби-Бауэра и Эриксона. 

Описание

Агар Мюллера-Хинтона изначально был разработан для первичной изоляции менингококков и гонококков.

При добавлении крови данная среда становится оптимальной для роста Neisseria. Также она становится более эффективной при повторном нагревании и превращении в шоколадный агар. Среду не следует переплавлять или повторно нагревать после добавления крови.

Приготовление

Добавить 38  г порошка в 1 л дистиллированной воды и дать настояться. Вскипятить до полного растворения среды. Стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре 121ºС.

Техника посева

Для культуры Neisseria достигаются наилучшие результаты при проведении инкубации во влажной камере с атмосферой, обогащенной СО₂. Если отсутствует возможность использования анаэростата, данные условия можно создать при помещении чашек в сосуд со свечой. Атмосфера внутри сосуда обогащена СО₂ в количестве от 5 до 8%.

Агар Мюллера-Хинтона зарекомендовал себя, как одна из наиболее эффективных сред для использования в тестировании на антимикробную чувствительность. Без добавления крови данную среду можно использовать для тестирования на чувствительность к сульфонамиду, поскольку среда свободна от большинства антагонистов (нуклеотиды и т.д.). При проведении данного анализа следует исследовать зоны ингибирования спустя 12-18 часов, перед возникновением чрезмерного роста, поскольку после 24 часов инкубации он может исказить результаты теста на чувствительность к сульфонамиду. Использование малого количества посевного материала способствует раннему образованию зон ингибирования. Количество инокулята должно быть в 100-300 раз меньше, чем используется для тестирования других антибиотиков. Данная среда была предложена ВОЗ в 1970 году для тестирования на антимикробную чувствительность и с тех пор широко используется. Тестирование на чувствительность можно проводить различными методами, как на твердой, так и в жидкой среде. Наиболее часто используемым в повседневной работе методом является тест Кирби-Бауэра, рекомендованный Американской Ассоциацией Клинических Патологов.

Метод Кирби-Бауэра является точной полуколичественной системой тестирования. В нем используется агар Мюллера-Хинтона и диски с высокой концентрацией антибиотика.

Посевной материал стандартизуют по МакФарланду, производят инокуляцию чашки мазком, погруженным в стандартизированную суспензию, после этого размещают на чашке диски на равном расстоянии друг от друга и проводят инкубацию (см. таблицу).

Некоторые авторы полагают, что посевной материал следует модифицировать путем внесения двойного слоя инокулированной среды. При использовании данной системы, несомненно, образуются более тонкие и выраженные зоны ингибирования. Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи и после этого измеряют зоны ингибирования. Результаты интерпретируют как Устойчивый, Умеренно Устойчивый (Средний) и Чувствительный штамм (см. таблицу).

В методе Эрикссона, принятом в большинстве европейских стран, используется стандартизованная культуральная среда (Мюллер-Хинтон), стандартизованное количество на чашку (25 мл на чашку диаметром 9 см) и стандартизованная концентрация посевного материала.

Используемую суспензию свежей культуры инкубируют в течение 18 часов в жидкой среде и затем готовят соответствующие разведения, чтобы убедиться в достаточном росте на агаре в течение 15 минут.

Рекомендуемые разведения:

-Enterobacteria- Pseudomonas: разведение 1/300

-Staphylococcus- Enterococcus: разведение 1/300

-Streptococcus- Haemophilus: разведение 1/10

Посевной материал вносят на чашку путем заливки на ее поверхность. Избыточный посевной материал удаляют стерильной пипеткой и распределяют на чашке соответствующим образом диски с антибиотиком. За 30-60 минут перед инкубацией разрешается провести предиффузионный период для медленной диффузии антибиотика перед ростом. После инкубации при 37°С в течение 12-18 часов производят измерение зон ингибирования и построение регрессионных кривых. Результаты приводят в терминах «Чувствительный» или «Резистентный», или в значениях минимальной ингибиторной концентрации.

Метод Эрикссона, несомненно, является более точным и надежным, чем метод Кирби-Бауэра. Тем не менее, метод Кирби, являющийся полуколичественным, более прост и легок в ежедневном использовании. Использование метода Эрикссона высоко рекомендовано при необходимости получения высокой эффективности и точности.

Чашки со средой Мюллера-Хинтона можно хранить при охлаждении в пластиковых пакетах в течение месяца без ущерба для результатов тестирования на чувствительность. Однако, не следует их использовать при любых признаках дегидратации среды. Агар Мюллера-Хинтона производства компании Scharlau соответствует требованиям ВОЗ для проведения тестов на микробную чувствительность; проверка его основных характеристик производится в каждой партии. Тем не менее, иногда может иметь место некоторая вариабельность результатов. Следует отметить ряд факторов, которые могут являться причиной вариабельности:

1. Поскольку питательные потребности организмов различаются, могут быть обнаружены штаммы, не способные к росту на данной среде, или растущие слабо.
2. На результаты могут повлиять такие факторы, как: объем посевного материала, скорость роста, состав среды и рН, измерение конечных точек. Таким образом, для получения надежных результатов следует строго придерживаться протокола.
3. Возможность применения дисковой диффузии для тестирования на чувствительность ограничена и может иметь место при работе с быстрорастущими организмами. При продолжительной инкубации, необходимой для медленно растущих организмов, может произойти инактивация препарата.
4. Среды, содержащие избыточное количество тимидина или тимина, могут обратить ингибиторный эффект сульфонамидов и триметоприма, в результате чего зоны ингибирования будут более малыми или менее различимыми.
5. Изменение концентрации дивалентных катионов, в основном кальция и магния, влияет на результаты тестирования изолятов Pseudomonasaeruginosa на устойчивость к аминогликозиду, тетрациклину и колистину. При избыточном количестве катионов размер зон ингибирования снижается, а пониженное содержание катионов вызывает обратный эффект.
6. Если среду Мюллера-Хинтона обогащают кровью, при тестировании на устойчивость к оксациллину и метициллину зоны ингибирования могут быть на 2-3 мм меньше, чем при использовании необогащенного агара. С другой стороны, при использовании овечьей крови может наблюдаться значительное увеличение диаметров зон при тестировании энтерококков на устойчивость к цефалоспоринам. Овечья кровь может являться причиной размытости зон или возникновения пленки биомассы в пределах зон ингибирования вокруг дисков с сульфонамидом и триметопримом.
7. При использовании среды Мюллера-Хинтона глубиной более 4 мм могут быть получены данные о ложной резистентности, а при использовании агара глубиной менее 4 мм – о ложной чувствительности.
8. Значение рН, находящееся вне предела 7,3 ± 0,1 , может неблагоприятно повлиять на результаты тестирования чувствительности. Если рН слишком низкий, аминогликозиды и макролиды утратят свою эффективность; другие виды антибиотиков могут проявить чрезмерную активность. При слишком высоком значении рН возможны противоположные эффекты.
9. При инокуляции среды Мюллера-Хинтона на поверхности или покрытии чашки Петри не должно быть видимых капель или влаги.
10. Среду Мюллера-Хинтона следует инокулировать не позднее, чем спустя 15 минут после приготовления суспензии.
11. Диаметры зон ингибирования некоторых препаратов, таких как макролиды, аминогликозиды и тетрациклины, существенно изменяются под воздействием СО₂. Чашки не следует инкубировать в атмосфере с повышенным содержанием СО₂.

Дополнительную информацию по проведению тестирования на чувствительность с использованием дисков с антибиотиками можно получить в Монографии М2-А9 CLSI (ранее – NCCLS).

Интерпретация зон подавления роста наиболее распространенных антибиотиков, согласно методу Кирби-Бауэра

Хранение

Среда предназначена только для лабораторного использования. Храните среду в банке с плотно закрытой крышкой, в темном, сухом, прохладном месте (при температуре от +4°C до 30°C и влажности <60%).

Контроль качества

Температура инкубации:  35°C ± 2,0

Время инкубации: 18-24 часов

Инокулируйте культуру на всю поверхность агара и нанесите антибиотик в соответствии с рекомендациями CLSI.

Артикул	Упаковка
01-136-500	500 г
01-136BA05	5х500 мл
064-BA1004	10 флаконов по 100 мл
064-PA0020	20 чашек Ø 90 мм