Клиническая оценка применения станции автоматизированного микробиологического посева (WASP) и транспортной системы ESwab для выделения культур Streptococcus agalactiae из проб, взятых для перинатального скрининга

Blake W. Buchan,^ab Wendy J. Olson,^a Tami-Lea A. Mackey,^b Nathan A. Ledeboer^a,b

Медицинский колледж Висконсин³и Лаборатория Динакейр (Милуоки, Висконсин, США)

 

Пробы из прямой кишки/влагалища (N =97) одновременно собирали в транспортные системы Eswab и вискозным зондом-тампоном и жидкой средой Стюарта (ВТС). Каждое из этих устройств для сбора пробприменяли для непосредственного посева на плотную питательную среду и в бульон LIM. Посев проб, собранных в транспортную системуESwab,осуществляли на станции автоматического микробиологического посева (WASP), а проб, собранных ВТС-вручную. Чувствительность культурального метода диагностики инфекции при посеве на плотную питательную среду проб, собранных в транспортную систему ESwab и ВТС, составила 93,8 и 87,5%, соответственно, и возрастала при посеве на обогатительный бульон до 96,9 и 90,6%, соответственно.

Транзиторную колонизацию урогенитального тракта Streptococcus agalactiae, известного также под названием «стрептококки группы В» (СГБ), считают фактором риска развития инфекции у новорожденных, которые инфицируются в момент родов. Для нее характерно развитие сепсиса, пневмонии и менингита в первые 7 дней жизни ребенка. Смертность достигает 7% (1, 2). Хотя заражение взрослых людей СГБ может сопровождаться бактериемией, инфекцией мягких тканей, пневмонией и менингитом (3), чаще всего оно носит форму бессимптомного носительства, инцидентность которого у беременных женщин составляет 10-30% (2, 4–6). Выявление СГБ в процессе планового пренатального скрининга помогает снижать инцидентность инвазивной формы инфекции у новорожденных посредством профилактической антибиотикотерапии беременных женщин, у которых диагностировали данную инфекцию (7). Центр по контролю и профилактике болезней (CDC, США) рекомендует проводить скрининг инфекции у женщин на 35-36 неделе гестации (2). Таким образом, чувствительные методы обнаружения СГБ в процессе планового пренатального скрининга служат ключевым компонентом профилактики заболеваемости новорожденных (2).

За счет использования жидких сред обогащения, селективных и хромогенных сред, а также методов молекулярной диагностики (6, 8–13) удается повысить вероятность обнаружения СГБ; однако, сбор проб клинического материала и их обработка остается по большей части неизменными. Совершенствование технологий и автоматизация сделали доступными для клинической микробиологии более эффективные методы сбора и обработки проб, что предоставляет возможность повысить чувствительность скрининга и выделения из исследуемого материала СГБ и других патогенов (14–18). Применение транспортных систем ESwab (Копан Диагностикс, Мерриета,Калифорния, США) в комбинации со станцией автоматизированного микробиологического посева (WASP) (Копан Диагностикс) может повысить эффективность и воспроизводимость сбора и обработки проб, выделения из них патогенных микроорганизмов за счет увеличения чувствительности и специфичности, а также снижения времени, затрачиваемого на проведение исследований (14–19). Традиционно применяемые транспортные системы, состоящие из волокнистого зонда-тампона и контейнера с непитательной транспортной средой, такой, как, например, жидкая среда Стюарта и полужидкая (гелевая) среда Эймса, обеспечивают сохранение микроорганизмов в процессе транспортировки собранных проб в лабораторию. Однако, недостаточно эффективное высвобождение микроорганизмов из традиционно применяемых с этой целью волокнистых зондов-тампонов может привести к снижению чувствительности диагностического исследования. Ворсистые зонды-тампоны сконструированы таким образом, что их плотная луковицеобразная головка (тампон) состоит из волокон, идущих в перпендикулярном направлении к стержню. Комбинация ворсистого зонда-тампона с жидкой транспортной средой в одной системе для сбора проб, например, ESwab, обеспечивает более равномерное распределение и большее высвобождение микроорганизмов; показано, что с помощью ESwab удается повысить сбор бактерий из раневого отделяемого и других проб по сравнению со стандартными волокнистыми зондами-тампонами (14–18). Это, в свою очередь, повышает количество микроорганизмов, высеваемых на плотные или иные питательные среды, обеспечивая большие стандартность и воспроизводимость процедуры, особенно при ее проведении на станциях автоматизированного микробиологического посева, таких, как WASP.

В ходе настоящего исследования сравнили эффективность применения транспортной системы ESwab и станции автоматизированного микробиологического посева WASP со стандартными методами сбора клинического материала в транспортную систему с жидкой средой Стюарта и вискозным зондом-тампоном (далее – ВТС) (BBL Culture Swabs; Бекто Диккенсон, Франкоин Лейкс, Нью-Йорк, США) и его посева для выделения S. agalactiae. В соответствии с запланированной схемой эксперимента у 97 беременных женщин взяли парные вагинально-ректальные пробы в каждую из сравниваемых транспортных систем (ESwab и ВТС) для проведения планового пренатального скрининга на инфекцию СГБ. Сначала брали пробы в ВТС, а затем в ESwab. Все собранные в обе транспортные тест-системы образцы хранили при комнатной температуре в течение 12 ч, после чего высевали на питательные среды. Материал из ВТС высевали на агар Гранада (Харди Диагностикс, Санта-Мария, Калифорния, США) и бульон LIM вручную в соответствии с общепринятым лабораторным регламентом, апробы, собранные в ESwab— вавтоматическом режиме на станции WASP с использованием бактериологической петли, калиброванной на 30 мкл. Процедура посева проб из ВТС на агар Гранада предусматривала прокатывание головки извлеченного из транспортной системы волокнистого зонда-тампона по поверхности  одного из секторов среды в чашке Петри. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяли штриховым методом по остальной поверхности среды. После этого волокнистый зонд-тампон перенос или в пробирку с обогатительным бульоном LIM и перед помещением в термостат перемешивали ее содержимое. Посевы на бульоне LIM инкубировали при температуре 35°Cв течение 18-24 ч и пересевали на агар Гранада вручную или автоматически (WASP) бактериологическими петлями, калиброванными на 10 и 30 мкл, соответственно. Посевы на агаре Гранада инкубировали при температуре 35°Cв анаэробных условиях, визуально инспектируя через 24 и 48 ч на наличие характерно окрашенных в оранжевый цвет колоний. СГБ первично идентифицировали в реакции латексагглютинации с помощью набора Streptex (Ремель, Ленекса, Канхас, США). Пробы считали «истинноположительными», если из них выделяли СГБ на среде Гранада (при прямом посеве проб из транспортных систем ВТС или ESwab либо при пересеве со среды обогащения.

Таблица 1. Сравнение эффективности (чувствительности и специфичности) выделенияS.agalactiaeиз клинического материала при ручном посеве проб и ВТС и автоматизированном (на WASP) посеве проб из ESwab

	N проб, давших указанный результат
Метод и тип транспортной системы	Истинно- положительные	Ложно-положительные	Истинно-негативные	Ложно- негативные	Всего проб	Чувствительность (%)	Специфичность(%)
Посев на плотную среду
Ручной из ВТС	28	0	65	4a	97	87.5	100.0
На WASP из ESwab	30	0	65	2b	97	93.8	100.0
С обогатительным культивированием
Ручной из ВТС	29	0	65	3c	97	90.6	100.0
На WASP из ESwab	31	0	65	1d	97	96.9	100.0

Примечания:

^a Из одной пробы выделили СГБ при ручном посеве из ВТС на обогатительный бульон LIM и при автоматизированном посеве на плотную среду и обогатительный бульонее дубликата из транспортной системыESwab. Остальные две пробы признали негативными при ручном посеве на обогатительную среду LIM из ВТС, но из их дубликатов выделили СГБ на плотной среде и обогатительном бульоне при автоматизированном посеве (WASP) из транспортной системы ESwab. Изоднойпробы, признанной негативной при ручном посеве на обогатительную среду LIMиз ВТС, выделили СГБ при автоматизированном посеве (на WASP) из транспортной системы ESwab только на плотной среде.

^b Две пробы признали положительными при посеве на обогатительную среду как ручным способомиз ВТС, так и автоматизированно (на WASP) из транспортной системы ESwab.

^c Три пробы признали положительными при автоматизированном (на WASP) посеве на плотную средуиз транспортной системы ESwab.

^d Одну пробу признали негативной при ручном посеве из ВТС на плотную и обогатительную среды и положительной при автоматизированном (на WASP) посеве из транспортной системы ESwab только на плотную среду.

При исследовании 97 проб S.agalactiae выделили в 32 (33%) случаях (Таблица 1). При первичном посеве проб из ВТС на жидкую обогатительную среду с последующим пересевом на агар Гранада чувствительность культурального метода диагностики составила 87,5% (28/32). Этот показатель при автоматизированном посеве проб из транспортной системы ESwab на станции WASP непосредственно на плотную среду составил 93,8% (30/32). Предварительное культивирование проб из транспортных систем ВТС и ESwab в обогатительном бульоне LIM обеспечило повышение чувствительности культурального метода диагностики до 90.6% (29/32) и 96,9% (31/32), соответственно. Посредством комбинации методов прямого посева проб на плотную среду и обогатительного культивирования в бульоне удалось повысить чувствительность культурального метода диагностики при посеве проб из транспортных систем ВТС и ESwabдо 100% (32/32) и 90,6% (29/32), соответственно.При прямом посеве на плотную среду после 24-часового инкубирования положительными признали 85,7% (24/28) проб из ВТС и 96,6% (29/30) проб из транспортной системы ESwab. Более высокая чувствительность культивирования посевов из транспортной системы ESwab в этот период коррелировала с более высокой концентрацией СГБ на агаре Гранада что могло стать следствием большего высвобождения бактерий из упомянутого устройства. Полученные данные указывают на более высокую чувствительность культурального метода диагностики инфекции СГБ при использовании транспортной системы ESwab и автоматизированного посева проб на станции WASPпо сравнению с обычно применяемым нами стандартным методом.

Только в одном случае при исследовании проб из транспортной системы ESwab получили ложноотрицательный результат при использовании обогатительного бульона LIM – при посеве той же пробы непосредственно на плотную среду выделили СГБ. Хотя считают, что предварительный посев на обогатительный бульон повышает чувствительность культурального метода диагностики данной инфекции, Dunneи Holland-Staley (8) показали, что этот метод и прямой посев на плотную среду обеспечивают приблизительно одинаковую чувствительность (≈85%) культуральному методу диагностики. Отсутствие положительного влияния этапа обогатительного культивирования на чувствительность последнего может быть обусловлена высоким титром в тестируемых пробах энтерококков, способных подавлять рост СГБ в обогатительном бульоне (8). Таким образом, максимальной чувствительности культурального метода диагностики СГБ удается достичь посредством комбинации обогатительного культивирования с непосредственным посевом проб на плотную среду.Это подтверждают и результаты проведенного нами эксперимента, в котором обогатительное культивирование в бульоне превышало по чувствительности непоредственный посев на плотную среду проб из обеих транспортных систем всего лишь на 3%. Комбинирование обоих методов позволяет добиться максимальной высеваемости СГБ из клинического материала – при таком подходе удается выделить бактерии из проб, собранных в транспортные системы ВТС и ESwab, в 90,6 и 100% случаев.

Мы не проводили дифференцированной оценки степени повышения чувствительности культурального метода диагностики инфекции СГБ при использовании транспортной системы ESwab и при автоматическом посеве проб на станции WASP, но полученные нами данные свидетельствую о том, что их комбинация повышает чувствительность лабораторного скрининга данной инфекции Это согласуется с наблюдениями, сделанными в аналогичной работе, показавшей возможность повышения высеваемости Staphylococcus aureus из клинического материала, собранного в транспортную систему ESwab, на 13,1 и 10,2% при его автоматизированном посеве на станции WASP на плотную среду и обогатительный бульон, соответственно, по сравнению с традиционной технологией культурального метода диагностики инфекции золотистого стафилококка, основанной на ручном посеве и применении волокнистых зондов тампонов (14). В других клинических исследованияхотмечено 6-кратное повышение титра и выделение большего числа культур микроорганизмов из раневого отделяемого, собранного транспортной системой ESwab, по сравнению с обычными зондами-тампонами (16). В заключение необходимо отметить, что несмотря на необходимость дополнительного изучения эффективности применения транспортной системы ESwab и посевной станции WASP для скрининговых исследований и выделения микроорганизмов из другого клинического материала, проведенная нами работа показала, что применение для отбора проб ворсистого зонда-тампона и их посев на автоматических микробиологических станциях может стать для клинических микробиологических лабораторий эффективным способом повышения чувствительности культурального метода диагностики инфекции СГБ.

 

Благодарности:

Мы благодарим компанию Копан Диагностикс за материальную поддержку данного исследования.

N.A.L. является консультантом компании Копан Диагностикс

 

Библиография:

1. Weston EJ, Pondo T, Lewis MM, Martell-Cleary P, Morin C, Jewell B, Daily P,Apostol M,Petit S, Farley M, Lynfield R, Reingold A, Hansen I, Stoll BJ, Shane AJ, Zell E,Schrag SJ. 2011. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005–2008. Pediatr. Infect. Dis. J. 30: 937–941. http://dx.doi.org/10.1097/INF.0b013e318223bad2.

2. Verani JR, McGee L,Schrag SJ. 2010. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 59(RR-10):1–32.

3. Skoff TH, Farley MM, Petit S,Craig AS, Schaffner W, Gershman K, Harrison LH, Lynfield R,Mohle-Boetani J,Zansky S, Albanese BA, Stefone kK, Zell ER, Jackson D, Thompson T, Schrag SJ. 2009. Increasing burden of invasive group B streptococcal disease in nonpregnant adults, 1990–2007. Clin. Infect. Dis.49: 85–92. http://dx.doi.org/10.1086/599369.

4. Javanmanesh F, Eshraghi N. 2013. Prevalence of positive recto-vaginal culture for Group B Streptococcus in pregnant women at 35–37 weeks of gestation. Med. J. Islam Repub. Iran 27: 7–11.

5. Page-Ramsey SM, Johnstone SK, Kim D, Ramsey PS. 2013. Prevalence of group B Streptococcus colonization in subsequent pregnancies of group B Streptococcus -colonized versus noncolonized women. Am. J. Perinatol. 30: 383–388. http://dx.doi.org/10.1055/s-0032-1326981.

6. Schwartz J, Robinson-Dunn B, Makin J, Boyanton BL, Jr. 2012. Evaluation of the BD MAX GBS assay to detect Streptococcus group B in LIM broth - enriched antepartum vaginal-rectal specimens. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73: 97–98. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio. 2012.01.016.

7. Van Dyke MK, Phares CR, Lynfield R, Thomas AR, ArnoldK E,Craig AS, Mohle-Boetani J, Gershman K,Schaffner W,Petit S, Zansky SM, Morin CA, Spina NL, Wymore K, Harrison LH, Shutt KA, Bareta J, Bulens SN, Zell ER, Schuchat A, Schrag SJ. 2009. Evaluation of universal antenatal screening for group B Streptococcus.N. Engl. J. Med. 360: 2626– 2636. http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa0806820.

8. Dunne WM, Jr, Holland-Staley CA. 1998. Comparison of NNA agar culture and selective broth culture for detection of group B streptococcal colonization in women. J. Clin. Microbiol. 36: 2298–2300.

9. Dunne WM, Jr. 1999. Comparison of selective broth medium plus neomycin-nalidixic acid agar and selective broth medium plus Columbia colistin-nalidixic acid agar for detection of group B streptococcal colonization in women. J. Clin. Microbiol. 37: 3705–3706.

10. de la Rosa M, Perez M, Carazo C, Pareja L, Peis JI, Hernandez F. 1992. New Granada medium for detection and identification of group B streptococci. J. Clin. Microbiol. 30: 1019–1021.

11. Verhoeven PO, Noyel P, Bonneau J, Carricajo A, Fonsale N, Ros A, Pozzetto B,Grattard F. 2014. Evaluation of the new Brilliance GBS chromogenic medium for screening of Streptococcus agalactiae vaginal colonization in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 52: 991–993. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02926-13.

12. El Helali N, Nguyen JC, Ly A, Giovangrandi Y, Trinquart L. 2009. Diagnostic accuracy of a rapid real-time polymerase chain reaction assay for universal intrapartum group B streptococcus screening. Clin. Infect. Dis. 49: 417–423. http://dx.doi.org/10.1086/600303.

13. Berg BR, Houseman JL, Garrasi MA,Young CL, Newton DW. 2013. Culture-based method with performance comparable to that of PCR- based methods for detection of group B Streptococcus in screening samples from pregnant women. J. Clin. Microbiol. 51: 1253–1255. http://dx.doi .org/10.1128/JCM.02780-12.

14. Jones G, Matthews R, Cunningham R,Jenks P. 2011.Comparison of automated processing of flocked swabs with manual processing of fiber swabs for detection of nasal carriage of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 49: 2717–2718. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.00504-11.

15. Nys S, Vijgen S, Magerman K, Cartuyvels R. 2010. Comparison of Copan ESwab with the Copan Venturi Transystem for the quantitative survival of Escherichia coli Streptococcus agalactiae and Candida albicans Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 29: 453–456. http://dx.doi.org/10.1007 /s10096-010-0883-5.

16. Saegeman V, Flamaing J, Muller J, Peetermans WE, Stuyck J, Verhaegen J. 2011. Clinical evaluation of the Copan ESwab for methicillinresistant Staphylococcus aureus detection and culture of wounds. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 943–949. http://dx.doi.org/10.1007 /s10096-011-1178-1.

17. Smismans A, Verhaegen J, Schuermans A, Frans J. 2009. Evaluation of the Copan ESwab transport system for the detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus: a laboratory and clinical study. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 65: 108–111. http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicro bio.2009.06.015.

18. Van Horn KG, Audette CD, Sebeck D,Tucker KA. 2008. Comparison of the Copan ESwab system with two Amies agar swab transport systems for maintenance of microorganism viability. J. Clin. Microbiol. 46: 1655– 1658. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02047-07.

19. Bourbeau PP, Swartz BL. 2009. First evaluation of the WASP, a new automated microbiology plating instrument. J. Clin. Microbiol. 47: 1101– 1106. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.01963-08.