(499) 957-83-07
ГлавнаяСпециалистуОценка пригодности транспортной системы Copan ESwab для посева B ...

Оценка пригодности транспортной системы Copan ESwab для посева Bordetella pertussis из образцов, взятых из носоглотки детей

21.03.2013

James J. Dunn1, Ann Croft2, Victor Hodson2, Mark A. Fisher2,3

1Детский медицинский центр Кука, Форт Ворт, Техас, 2Региональный и университетский патоморфолог, Солт Лейк Сити, Юта,

3Университет Юты, отдел патологии, Солт Лейк Сити, Юта

 

Краткое содержание

Освещение проблемы: Коклюш – высоко контагиозная, предотвращаемая вакцинацией респираторная инфекция, вызываемая бактерией Bordetella pertussis. Диагностика коклюша продвинулась вперёд с появлением тестов, основанных на методах амплификации нуклеиновых кислот, таких как ПЦР. Тем не менее, рекомендации центра по диагностике и контролю заболеваний (CDC – Center for Disease Control) включают в себя посев, особенно при вспышках заболевания. Коэффициент сохранения жизнеспособности B. pertussis при посеве обычно составляет от 12% до 60% по сравнению с выявлением возбудителя пи помощи ПЦР.

Методы: В данном исследовании была проведена оценка пригодности транспортной системы Copan ESwab для посева B. pertussis из образцов, взятых из носоглотки (NP – nasopharyngeal) 223 детей (средний возраст 3,3 года; медиана возраста 1,5 года). С помощью системы ESwab из носоглотки каждого пациента брали два образца, один из которых исследовался на наличие B. pertussis с помощью ПЦР в реальном времени, а второй был отправлен в специализированную лабораторию для посева на агар Регана-Лоу. Среднее время до ПЦР после взятия образцов составляло 18 ч, все транспортные системы ESwab до транспортировки хранились при 4°С. Среднее время с момента сбора образцов до посева составляло 50 ч (медиана 47ч).

Результаты: Из 76 образцов, собранных с помощью системы ESwab и транспортировавшихся при комнатной температуре, ПЦР выявила B. pertussis в 9 случаях, посев не выявил ни в одном случае, в 21% случае при посеве имел место чрезмерный рост плесневых грибов или грам-отрицательных палочек. Из 147 образцов, собранных с помощью системы ESwab и транспортировавшихся при 4°С, ПЦР выявила B. pertussis в 36 случаях, и из них 8 дали положительный результат на B. pertussis при посеве. В 6 случаях при положительном результате посева B. pertussis сохранял жизнеспособность в образцах, хранившихся при 4°С не менее 79 ч, а в трех образцах был обнаружен B. pertussis, сохранивший жизнеспособность не менее чем 5 дней. Чрезмерный рост плесневых грибов или грам-отрицательных палочек обнаружился в 10% образцов, транспортированных при 4°C. Средняя величина пороговой линии (Ct – crossing threshold) при ПЦР составляла для положительных образцов, собранных с помощью системы ESwab, 18,3, для отрицательных – 28,3.

Выводы: Как и в случае с другими транспортными системами, используемыми для выделения B. pertussis, чувствительность посева с использованием системы ESwab низка по сравнению с ПЦР, а жизнеспособность возбудителя может быть снижена из-за чрезмерного роста других организмов, мешающего развитию B. persussis. В настоящее время проводятся исследования по сравнению коэффициента жизнеспособности B. pertussis в образцах, взятых из носоглотки, при использовании системы ESwab и столбика с агаром Регана-Лоу в одних и тех же условиях транспортировки.

Материалы и методы

С помощью системы ESwab (Copan Diagnostics, Мурриета, Калифорния) у пациентов в двух повторностях были взяты мазки из носоглотки. Один мазок был использован для ПЦР-диагностики, а другой отослан в специализированную лабораторию для посева. Образцы были разделены на четыре группы (см. таблицу 1).

ПЦР в реальном времени

Амплификация и определение участка ДНК B. pertussis IS481 размером 114 пар нуклеотидов проводилось согласно описанному ранее протоколу (Hood et al.) с использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из 1 мл отцентрифугированного образца, собранного с помощью системы ESwab. Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем протеиназу K, и нагревали при 100°C в течение 10 минут. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с помощью станции Qiagen Biorobot EZ1 и набора для выделения ДНК из тканей, после чего проводили элюцию с помощью 60 мкл буфера для элюции. Десять мкл элюата добавляли к реакционной смеси, содержавшей смесь для ПЦР Taqman Universal PCR (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния), экзогенный внутренний контроль (Applied Biosystems), 900 мкМ смеси прямых и обратных праймеров и 300 мкМ зонда в общем реакционном объёме 50 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems) при следующих параметрах циклов: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, 45 циклов - 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Образцы со средней величиной пороговой линии < 35 считались положительными на B. pertussis.

Посев

       Посев образцов из групп 1-3 проводился следующим образом:

  • Пробирки энергично встряхивали, инокулировали 50 мкл жидкости на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу (BD, Sparks, MD Hardy Diagnostics, Санта Мария, Калифорния) и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
  • Пересев проводили ежедневно в течение 5 дней по вышеуказанной методике.
  • Чашки инкубировали в течение 7 дней при 35°С в обычной атмосфере.
  • Чашки ежедневно учитывались, а результаты регистрировались.
  • Положительный результата посева подтверждали с помощью флуоресцентного окрашивания антителами к Bordiella pertussis (BD-Difco).

Посев образцов из группы 4 проводился следующим образом:

  • Пробирки энергично встряхивали, инокулировали 50 мкл жидкости на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
  • Пробирки ESwab центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин и удаляли большую часть супернатанта.
  • Осадок ресуспендировали, инокулировали 50 мкл на каждую из двух чашек Петри с агаром Регана-Лоу и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
  • Материал из пробирок со столбиками агара Регана-Лоу (Hardy Diagnostics) инокулировали на чашки с агаром Регана-Лоу в двух повторностях и рассевали штрихом для получения отдельных колоний.
  • Чашки инкубировали в течение 7 дней при 35°С в обычной атмосфере.
  • Чашки ежедневно учитывались, а результаты регистрировались.
  • Положительный результата посева подтверждали с помощью флуоресцентного окрашивания антителами к Bordiella pertussis (BD-Difco).

Анализ данных

Статистический анализ был выполнен с использованием t-критерия Стьюдента, точного критерия Фишера или дисперсионного анализа с помощью программы GraphPad Prism v5 (GraphPad, Ла Джолла, Калифорния).

Результаты

Таблица 1. Описание категорий образцов.

Группа 1 (N=76)

ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные образцы

Транспортировка и хранение при комнатной температуре

Группа 2 (N=123)

ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные образцы

Транспортировка и хранение в холодильнике

Группа 3 (N=17)

ПЦР-положительные образцы

Транспортировка и хранение в холодильнике

Группа 4 (N=7)

ПЦР-положительные образцы

Два образца – один хранился в системе ESwab, второй – на агаре Регана-Лоу

Транспортировка и хранение в холодильнике

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 1. Результаты ПЦР, посева и уровень контаминации. Для каждой категории образцов показано количество образцов, оказавшихся положительными при ПЦР и при посеве, а также образцов с контаминацией

 

Рисунок 2. Среднее время до посева и средние величины пороговой линии. Для каждой категории образцов показано среднее время от взятия образца до посева и средние величины пороговой линии при ПЦР

Рисунок 3. Пороговые линии результатов ПЦР. Для восьми образцов B. pertussis с положительным результатом посева среднее значение пороговой линии (Ct) при ПЦР составляло 18,3 ± 6,4. Для 28 образцов B. pertussis с отрицательным результатом посева и положительным при ПЦР среднее значение Ct составило 28,3 ± 4,6. Данное различие было статистически значимым при использовании t-критерия Стьюдента (p<0,001).

Обсуждение и выводы

Обсуждение

♦ Целью данного исследования было определение возможности использования системы ESwab в качестве альтернативы агару Регана-Лоу для поддержания жизнеспособности B. pertussis при транспортировке. Как и для других транспортных сред ранее, при использовании системы ESwab мы наблюдали низкие показатели положительного ответа при посеве на B. pertussis (18%).

 Образцы с более низкими значениями пороговой линии (показатель более высокой концентрации микроорганизмов) гораздо чаще давали положительный результат при посеве (p<0,001), чем образцы с высокими значениями (более низкая концентрация микроорганизмов), которые в основном давали отрицательный ответ. Образцов с положительным результатом посева и отрицательным результатом ПЦР не было.

• Между значениями пороговой линии для образцов, транспортировавшихся при комнатной температуре (все посевы отрицательны), и  значениями для образцов с положительным результатом посева не было значительных различий, что свидетельствует о том, что транспортировка при комнатной температуре может отрицательно сказываться на жизнеспособности B. pertussis.

♦ Во многих культурах наблюдалась контаминация другими грам-отрицательными палочками или плесневыми грибами, что могло снизить жизнеспособность B. pertussis.

♦ Влияние температуры транспортировки на жизнеспособность B. pertussis сложно оценить, поскольку в большинстве культур микроорганизм не выжил. Тем не менее, средние значения Ct указывают на снижение жизнеспособности при комнатной температуре.

Температура транспортировки не влияла на контаминацию; чрезмерный рост чаще наблюдался в образцах, хранившихся при комнатной температуре, чем в образцах, хранившихся при охлаждении (p=0,0352)

Для единственной пары посевов с положительным результатом из группы 4 транспортировка с помощью системы ESwab и агара Регана-Лоу дала равное количество колоний B. pertussis. Они транспортировались и хранились в одинаковых условиях и, по-видимому, одинаково были способны поддерживать жизнеспособность B. pertussis. В этой группе не удалось исследовать все образцы из-за снижения количества ПЦР-положительных образцов к концу срока исследования.

♦ Между длительностью транспортировки и сроком сохранения жизнеспособности  B. pertussis прямой корреляции не было. Наиболее короткий срок транспортировки для образца с положительным результатом посева составлял 31 ч (Ct=14,5), а наиболее длинный – 62 ч (Ct=31,3). B. pertussis удалось выделить из этого последнего образца более чем через 6 дней с момента его получения. Повторные посевы со среды ESwab давали положительный результат до 5 дней (3,4 дня в среднем), за исключением двух образцов, посев которых был положительным лишь 1 день.

Выводы

Посев на B. pertussis обладает малой чувствительностью по сравнению с ПЦР. Успех посева может зависеть от таких факторов, как температура и срок транспортировки, концентрация микроорганизма и присутствие других микроорганизмов. В совокупности данные наблюдения свидетельствуют о том, что жизнеспособность B. pertussis после транспортировки образца с помощью системы ESwab может быть очень разной.

Из-за малого количества образцов, протестированных на обеих средах, необходимы дальнейшие исследования с целью достоверного сравнения способности системы ESwab и агара Регана-Лоу поддерживать жизнеспособность B. pertussis в процессе транспортировки.

Ссылки

Hood, J.L., J.J. Dunn, and D.K. Murphey. 2008. Outbreak of hospital acquired pertussis in newborn infants in Texas, 2004. Morbidity and Mortality Weekly Report 57(22):600-603.

Wendelboe, A.M. and A. Van Rie. 2006. Diagnosis of pertussis: a historical review and recent developments. Expert Rev. Mol. Diagn. 6(6):857-864.

COPANSocorexLP ITALIANA SPAMASTScharlauGLW Storing Systems GmbH