Оценка транспортной системы на основе флокированных нейлоновых тампонов Copan ESwab для поддержания жизнеспособности анаэробных бактерий
Медицинский факультет университета Индианы, Клиническая лаборатория Клариан (Clarian Pathology Laboratory), г. Индианаполис, Индиана, США
Недавно разработанная транспортная система ESwab основана на использовании нейлоновых флок-тампонов для сбора проб в сочетании с жидкой транспортной средой Эймса. Потенциально система позволяет собрать большее количество материала и высвобождает в среду более высокую долю микроорганизмов, чем тампоны из скрученных волокон в сочетании с агаровой транспортной средой. Однако эффективность использования этих систем в отношении анаэробных микроорганизмов в настоящее время неизвестна. Целью настоящего исследования была количественная оценка способности системы ESwab поддерживать жизнеспособность ряда клинически значимых анаэробных бактерий. Для сравнения использовалась транспортная система BBL Port-A-Cul (PAC) с агаровой средой и тампоном из полиэстера.
Методы: для оценки в рамках данного исследования были выбраны 11 штаммов ATCC и 14 свежих штаммов выделенных в клинических условиях. Количественное определение жизнеспособности выполнялось троекратно при хранении в условиях контрольной комнатной температуры (КТ) и в холодильнике в одно время (4ºC). Для каждой комбинации «микроорганизм/система для взятия проб тампоном» подсчет жизнеспособных бактерий проводился в моменты времени «0 часов», «24 часа» и «48 часов» по методу количественного элюирования CLSI-40A.
Результаты:
В временной точке «0 часов» количество жизнеспособных бактерий 9 изученных штаммов анаэробов при использовании системы ESwab было на порядок выше (1 log по основанию 10), чем при использовании системы PAC. После хранения тампонов в течение 24 часов при температуре 4ºC выход микроорганизмов составил 76% для системы ESwab и 32% для системы PAC в сравнении с соответствующими показателями во временной точке «0 часов» (оценивалось среднее количество колониеобразующих единиц в 1 мл среды для каждого из 9 исследуемых штаммов). Через 48 часов экспозиции при температуре 4ºC высеваемость при использовании системы ESwab составила 59%, а при использовании системы PAC — 17% от значения показателя во временной точке «0 часов». После экспозиции при КТ в сравнении с временной точкой «0 часов» показатель общей высеваемости анаэробов с помощью системы ESwabs составил 12% через 24 часа и 2% — через 48 часов. Для системы PAC высеваемость через 24 часа составила 17%, а через 48 часов — 9% от исходной. При КТ выживаемость тестируемых анаэробов была доказана для обеих систем; единственным исключением оказался микроорганизм Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, который при использовании системы ESwab во временной точке «48 часов» был нежизнеспособным.
Выводы:
Результаты свидетельствуют о том, что система ESwab на основе флокированных нейлоновых тампонов в сочетании с жидкой транспортной средой Эймса может использоваться для поддержания жизнеспособности клинически значимых анаэробных бактерий во время транспортировки и хранения при температурах 25ºC и 4ºC. При этом более высокая выживаемость анаэробных микроорганизмов отмечалась в условиях хранения при температуре 4ºC, чем при КТ, хотя и при КТ система поддерживала выживаемость большинства исследуемых анаэробов в течение 48 часов.
Ключевым моментом в диагностике анаэробных бактериальных инфекций является выбор, взятие образцов и их транспортировка. Чаще всего при этом используются тампоны с транспортной средой. Хотя взятие образцов с помощью тампона менее желательно, чем аспирация шприцом с иглой или биопсия ткани для получения культуры анаэробов (4), остается верным тот факт, что серийно выпускаемые транспортные системы с тампоном все также широко используются лечебными учреждениями для этих целей. Сегодня в большинстве клинических случаев взятые образцы направляют для обработки в центральную или специализированную лабораторию. При этом неминуемо возникают задержки, связанные с транспортировкой. Жизнеспособность микроорганизмов во взятом образце должна сохраняться в течение длительного периода.
Недавно разработанная транспортная система ESwab была создана для поддержания жизнеспособности бактерий (аэробов, анаэробов и прихотливых микроорганизмов) в клинических образцах при комнатной температуре или при охлаждении на протяжении периода длительностью до 48 часов. Система состоит из нейлонового флок-тампона и полипропиленовой пробирки с закручивающейся крышкой, содержащей 1 мл среды Эймса (Рисунок 1).
Целью настоящего исследования была количественная оценка способности системы ESwab поддерживать жизнеспособность ряда клинически значимых анаэробных бактерий. Для сравнения использовалась транспортная система BBL Port-A-Cul (PAC) с агаровой средой и тампоном из полиэстера. Метод количественного элюирования CLSI M40-A (1) использовался для анализа показателей выживаемости большего количества видов анаэробных бактерий, чем сообщалось ранее (2,3).
1. Перед использованием в качестве материала для посева все бактерии были не менее трех раз пересеяны на анаэробном кровяном агаре.
2. Колонии переносили в 3-миллилитровый объем 0,85%-го стерильного физиологического раствора до достижения мутности 0,5 по стандарту МакФарланда (~1,5x108 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл).
3. После десятикратного разведения инокулята 0,85%-м стерильным физиологическим раствором получали суспензию, содержащую 1,5 x107 КОЕ/мл.
4. 100 мкл хорошо перемешанного инокулята переносили с помощью пипетки в каждую из 6 пробирок Эппендорф, по три пробирки для каждой из транспортных систем Port-A-Cul (PAC) и ESwab. Три тампона каждой из систем помещали в отдельные пробирки и оставляли для осуществления абсорбции не менее чем на 10 секунд.
5. Тампоны с инокулятом помещали в соответствующие транспортные системы и оставляли для использования во временной точке «0 часов».
6. Еще двенадцать тампонов для каждой из транспортных систем помещали в инокулят аналогичным образом, после чего тампоны переносили в соответствующие транспортные системы и выдерживали в течение 24 или 48 часов при комнатной температуре или в холодильнике.
7. Время выполнения посева не превышало 20 минут от момента приготовления суспензии для посева до момента, когда все тампоны с инокулятом были помещены в соответствующую транспортную систему, а транспортные системы — в соответствующие условия экспозиции.
8. Для подсчета колоний при использовании системы BD PAC тампон вынимали из транспортной системы и помещали в 0,85 %-й физиологический раствор объемом 1 мл (pH 6,8–7,2). Так получали первичную суспензию, которую энергично перемешивали в течение 15 секунд, после чего из тампона отжимали лишнюю жидкость.
9. Была проведена серия десятикратных разведений (10-1, 10-2 и 10-3) 0,85%-м физиологическим раствором (pH 6,8–7,2), в результате чего получали материал для посева с концентрацией 105, 104 и 103.
10. 100 мкл каждого раствора, включая первичную суспензию, равномерно наносили на поверхность питательной среды стерильным бактериологическим шпателем (в двух экземплярах). Затем пункты 7-9 повторяли до тех пор, пока образцы, взятые с помощью каждого из тампонов, не были соответствующим образом разведены и посеяны.
11. Затем чашки помещали в анаэростат (glove box) до появления видимых поддающихся подсчету колоний.
12. Подсчет колоний для системы ESwab выполнялся сходным образом, за исключением того, что первичной суспензией служила транспортная среда системы ESwab, содержащая 1 мл жидкой среды Эймса. Остальные этапы были идентичными.
13. При появлении видимых и поддающихся подсчету колоний во всех чашках, проводился подсчет колоний, результаты которого регистрировались по каждому разведению для каждого тампона и температуры экспозиции.
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что нейлоновые флок-тампоны ESwab дают больший выход анаэробных бактерий в сравнении с тампонами PAC, на что указывает более высокое количество колоний во временной точке «0 часов» для 24 из 25 исследованных штаммов анаэробных бактерий. Единственным исключением стал штамм B. fragilis (5,42 log10 КОЕ/мл из тампона ESwab при 5,52 log10 КОЕ/мл из тампона PAC).
Система ESwab является достойной альтернативой применению системы PAC для поддержания жизнеспособности клинически значимых анаэробных бактерий при хранении в холодильнике или при комнатной температуре. При этом более высокая выживаемость анаэробных микроорганизмов отмечалась в условиях хранения при температуре 4ºC, чем при КТ, хотя и при КТ система поддерживала выживаемость большинства исследуемых анаэробов в течение 48 часов.
Следует отметить, что плохая выживаемость или отсутствие выживаемости были отмечены для некоторых клостридий и прихотливых анаэробных грамотрицательных палочек при экспозиции в условиях комнатной температуры или в холодильнике для обеих исследуемых систем (ESwab и PAC) во временных точках «24 часа» и «48 часов». Для оценки времени выживаемости этих клостридий и прихотливых анаэробных грамотрицательных палочек при использовании обеих систем следует провести дополнительные исследования (то есть, на временных отрезках < 24 ч).
